一种双段控温并流加吐温60提高普鲁兰多糖产量的方法技术

本发明专利技术涉及一种通过双段控温并流加吐温60来提高普鲁兰多糖产量的方法，在出芽短梗霉发酵培养过程中，当菌体生长处于适应期(发酵液OD620＜0.5)时，控制温度32℃，当菌体生长处于对数期初期(发酵液OD620≥0.5)时，控制温度至28℃，并流加发酵液体积0.08％-0.12％的吐温60，缩短发酵周期，发酵时间为58-63h。本发明专利技术根据菌体在不同生长周期最适生长温度不同以及菌体在次级代谢产物合成时流加适量吐温60来提高普鲁兰多糖产量，操作便捷，效果明显，较大地缩短了发酵周期，提高了底物的转化率，降低了普鲁兰多糖的成本。

【技术实现步骤摘要】
一种双段控温并流加吐温60提高普鲁兰多糖产量的方法
本专利技术涉及一种微生物发酵生产普鲁兰多糖的方法，具体涉及一种双段控温并流加吐温60来提高普鲁兰多糖产量的方法，属于生物发酵工程

技术介绍
普鲁兰多糖是一种类似葡聚糖、黄原胶的胞外水溶性粘质微生物胞外多糖，是葡萄糖以α-1，4-糖苷键结合成麦芽三糖，两端再以α-1，6-糖苷键同另外的麦芽三糖结合，如此反复连接而成高分子聚合物。普鲁兰多糖已作为乳化剂、悬浮剂、增稠剂、稳定剂、胶凝剂、成膜剂和润滑剂等广泛应用于食品、制药、石油、化工等多个领域。其将是今后新型发酵工程的一个重要发展方向，越来越受到国内企业的重视。表面活性剂，是指加入少量能使其溶液体系的界面状态发生明显变化的物质。具有固定的亲水亲油基团，在溶液的表面能定向排列。吐温60是一种常见常用的非离子型表面活性剂，其可以改善细胞膜通透性。目前文献当中关于普鲁兰多糖产量提高主要是通过菌种诱变、培养基成分优化，往往效果不太明显，发酵周期长，且底物的转化率不高，导致普鲁兰多糖成本居高不下。申请号为201210594876.4的中国专利技术专利《大量生产普鲁兰多糖的诱变菌株及其培养方法》，公开了一株产普鲁兰多糖的出芽短梗霉CGMCCNO.7055，并公开了利用该菌株生产普鲁兰多糖的方法，以及发酵培养基组成。出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)BCSWGHPL101在发酵培养基发酵生产普鲁兰多糖产量为96g/L，较原始菌株68±5.2g/L的产量，提高了41.2％，发酵条件为28℃，200±20rpm下培养3d。但仍存在发酵周期较长，且底物转化率较低，底物利用率不高的问题，导致普鲁兰多糖成本较高，不利于大批量、规模化生产。
技术实现思路
为了缩短普鲁兰多糖发酵周期，提高底物转化率，有针对性的提高普鲁兰多糖产量，本专利技术提供了一种双段控温并流加吐温60来提高普鲁兰多糖产量的方法，不仅操作方便，而且在提高产量的同时也减少了色素的产生。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种提高普鲁兰多糖产量的方法，包括以下步骤：1)种子培养将出芽短梗霉菌株进行活化后转接到种子培养基进行培养，培养温度为32℃，摇床转速为180rpm，培养时间为28-32h。所述种子培养基组成(g/L)：蔗糖10，酵母浸粉0.3，氯化钠0.25，磷酸氢二钾0.2，硫酸铵0.1，硫酸镁0.04，硫酸亚铁0.05，蒸馏水定容至100mL后用3mol/L的盐酸溶液调制pH＝6±0.1，121℃灭菌20分钟。2)发酵培养5L发酵罐发酵培养基装液量1.8L，接种量为4％(V/V)，当菌体生长处于适应期(发酵液OD620＜0.5)时，控制温度32℃，当菌体生长处于对数期初期(发酵液OD620≥0.5)时，控制温度至28℃，并流加发酵液体积0.08％-0.12％的吐温60，缩短发酵周期，发酵时间为58-63h。所述发酵培养基组成(g/L)：蔗糖150，蛋白胨5，磷酸氢二钾7，硫酸镁0.4，氯化钠3，硫酸亚铁0.05，用3mol/L的盐酸溶液调制pH＝6±0.1，按0.1‰量添加泡敌(植物油)，121℃灭菌20分钟。3)普鲁兰多糖的分离发酵液过滤除菌体后，加入两倍乙醇，搅拌，4℃静置过夜，离心后，再使用无水乙醇冲洗2遍，干燥得白色普鲁兰多糖粗品。所述出芽短梗霉菌株优选使用专利CN103060204B公开的一株保藏编号为CGMCCNO.7055的出芽短梗霉。有益效果：本专利技术针对出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖过程中存在周期长、底物转化率低的缺陷，进行了大量实验，得出结论为在菌体处于适应期时，菌体最适生长温度为32℃，菌体处于对数期时温度控制在28℃更有利于次级代谢产物即普鲁兰多糖的积累，并流加一定量吐温60可以促进菌体细胞膜的通透性，使之产生的次级代谢产物即普鲁兰多糖能够及时排到细胞膜外，为后续普鲁兰多糖的大量积累提供了保证。本专利技术根据菌体在不同生长周期最适生长温度不同以及菌体在次级代谢产物合成时流加适量吐温60来提高普鲁兰多糖产量，操作便捷，效果明显，较大地缩短了发酵周期，提高了底物的转化率，降低了普鲁兰多糖的成本。具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本专利技术方法。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。实施例1：以发酵过程不流加吐温60作为对照。(1)种子培养将出芽短梗霉菌株进行活化后转接到500ml挡板瓶中，培养基装液量100ml，培养温度为32℃，摇床转速为180rpm，培养时间为28h。(2)发酵培养5L发酵罐装液量1.8L，接种量为4％(V/V)，当菌体生长处于稳定期前期时(OD620＜0.5)温度32℃，转速为400rpm进行培养，当菌体生长处于对数期前期时(OD620＞0.5)，温度设定为28℃。(3)普鲁兰多糖的分离发酵液滤除菌体后，加入两倍乙醇，搅拌，4℃静置过夜，离心后，再使用无水乙醇冲洗2遍，干燥得白色普鲁兰多糖粗品65.5g/L，发酵周期为72h。实施例2(1)种子培养将出芽短梗霉菌株进行活化后转接到500ml挡板瓶中，培养基装液量100ml，培养温度为32℃，摇床转速为180rpm，培养时间为28h。(2)发酵培养5L发酵罐装液量1.8L，接种量为4％(V/V)，当菌体生长处于稳定期前期时(OD620＜0.5)温度32℃，转速为400rpm进行培养，当菌体生长处于对数期前期时(OD620＞0.5)，温度设定为28℃并流加0.08％的吐温60，促进次级代谢产物即普鲁兰多糖的积累。(3)普鲁兰多糖的分离发酵液滤除菌体后，加入两倍乙醇，搅拌，4℃静置过夜，离心后，再使用无水乙醇冲洗2遍，干燥得白色普鲁兰多糖粗品74.9g/L。发酵周期为61h，与未添加吐温60发酵周期需要72h相比，缩短了11h，普鲁兰多糖产量提高了14.35％。实施例3(1)种子培养将出芽短梗霉菌株进行活化后转接到500ml挡板瓶中，培养基装液量100ml，培养温度为32℃，摇床转速为180rpm，培养时间为30h。(2)发酵培养5L发酵罐装液量1.8L，接种量为4％(V/V)，当菌体生长处于稳定期前期时(OD620＜0.5)温度32℃，转速为400rpm进行培养，当菌体生长处于对数期前期时(OD620＞0.5)，温度设定为28℃并流加0.1％的吐温60，促进次级代谢产物即普鲁兰多糖的积累。(3)普鲁兰多糖的分离发酵液滤除菌体后，加入两倍乙醇，搅拌，4℃静置过夜，离心后，再使用无水乙醇冲洗2遍，干燥得白色普鲁兰多糖粗品75.3g/L。发酵周期为60h；与未添加吐温60发酵周期需要72h相比，缩短了12h，普鲁兰多糖产量提高了14.96％。实施例4(1)种子培养将出芽短梗霉菌株进行活化后转接到500ml挡板瓶中，培养基装液量100ml，培养温度为32℃，摇床转速为180rpm，培养时间为32h。(2)发酵培养5L发酵罐装液量1.8L，接种量为4％(V/V)，当菌体生长处于稳定期前期时(OD620＜0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高普鲁兰多糖产量的方法，包括以下步骤：1)种子培养：将出芽短梗霉菌株进行活化后挑一环转接到种子培养基进行培养，培养温度为32℃，摇床转速为180rpm，培养时间为28‑32h；2)发酵培养：5L发酵罐发酵培养基装液量1.8L，接种量为4％(V/V)，当发酵液OD620＜0.5时，控制温度32℃，当发酵液OD620≥0.5时，控制温度至28℃，并流加发酵液体积0.08％‑0.12％的吐温60，发酵时间为58‑63h；3)普鲁兰多糖的分离发酵液过滤除菌体后，加入两倍乙醇，搅拌，4℃静置过夜，离心后，再使用无水乙醇冲洗2遍，干燥得白色普鲁兰多糖粗品。

【技术特征摘要】
1.一种提高普鲁兰多糖产量的方法，包括以下步骤：1)种子培养：将出芽短梗霉菌株进行活化后挑一环转接到种子培养基进行培养，培养温度为32℃，摇床转速为180rpm，培养时间为28-32h；2)发酵培养：5L发酵罐发酵培养基装液量1.8L，接种量为发酵液体积的4％，当发酵液OD620＜0.5时，控制温度32℃，当发酵液OD620≥0.5时，控制温度至28℃，并流加发酵液体积0.08％-0.12％的吐温60，发酵时间为58-63h；3)普鲁兰多糖的分离发酵液过滤除菌体后，加入两倍乙醇，搅拌，4℃静置过夜，离心后，再使用无水乙醇冲洗2遍，干燥得白色普鲁兰多糖粗品。2.如权利要求1所述的一种提高普鲁兰多糖产量的方法，其特征在于，所述种子培养基组成为：蔗糖10g/...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔长晟，王建梓，李振海，郝华璇，冯杰，
申请(专利权)人：天津北洋百川生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12