一种鸡显性白羽基因的鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种鸡显性白羽基因的鉴定的方法。本发明专利技术提供了用于鉴定鸡显性白羽基因的引物，具体为由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对。实验证明，利用本发明专利技术所提供的方法鉴定鸡显性白羽基因的基因型（II基因型或Ii基因型或ii基因型），具有如下优点：操作简单、检测快速、结果准确、毒性低、适用范围广等。本发明专利技术对于白羽鸡的育种具有重要意义，有利于在育种实践中更有效的对白羽性状进行选择，以指导鸡显性白羽性状的分子遗传标记选育。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于动物遗传育种领域，涉及一种鸡显性白羽基因的鉴定方法。
技术介绍
鸡羽色表型是一类复杂的质量性状，受多种基因调控。羽色性状的相关研究较多，但相关基因功能及其突变的研究较少，目前只有少部分基因得到证实与特定羽色的形成有关。鸡的羽色可分为白羽和有色羽。鸡的白羽又分为显性白羽和隐性白羽两类。其中，显性白羽鸡以白来航鸡为代表，隐性白羽鸡如丝羽乌骨鸡和各种隐性白鸡，有色羽鸡如寿光鸡等。显性白羽基因是影响鸡羽色的一个主要基因座位，定位于第22连锁群（E22C19W28），该连锁群与人类第12号及小鼠第10号染色体同源，该基因编码黑素细胞特异的PMEL17蛋白。该基因在真黑素小体早期发育过程中发挥关键作用，当黑色素在成熟的黑素体中合成时，会沉积在一种腔内纤维状组织。这种纤维会螯合并聚集黑色素。这种纤维的形成是黑素体生成过程中关键的一步。有研究表明黑素细胞中条纹状纤维的形成有赖于PMEL17蛋白的裂解。Kerje等研究发现显性白羽鸡PMEL17基因序列的第10外显子上的9bp插入突变是显性白羽性状形成的主要原因，插入突变导致该蛋白跨膜区多出3个氨基酸，而使其编码的蛋白跨膜域结构发生改变，从而阻碍了黑色素的沉着，这就导致了显性白羽性状的形成。其所对应的等位基因为I，而隐性等位基因i不含该突变。对应的显性白羽鸡的基因型为I-，有色羽或隐性白羽鸡的基因型为ii。韩国首尔国立大学JIN WON CHOI等利用等位基因特异性PCR技术对白来航、韩国Ogol鸡和横斑洛克鸡的PMEL17基因的突变位点进行了检测，其中提供了两对等位基因特异性引物检测PMEL17基因的9bp突变位点，这两对引物的下游引物相同，设在突变位点之后，检测显性突变的上游引物设在突变位点附近，其中3’末端4个碱基与9bp突变位点上的碱基相配对，检测非显性突变的上游引物与检测显性突变的上游引物起始位点一致，但是3’末端4个碱基与9bp突变位点之后紧挨的4个碱基相配对，该方法在做检测时，每个样本都需要用这两对引物分别检测，综合两者结果才能准确判断样本的基因型。当样本量加大，不仅检测量翻倍，同时还会产生较多的误差，影响检测效率。刘文博等利用混合样本池法对不同鸡的PMEL17基因突变位点进行了检测，验证了在相同实验条件下，PCR产物混合样本池法的检测精度高于DNA样本混合池法。该方法利用PAGE胶直接检测9bp插入突变，能够分辨不同的基因型，但PAGE胶配制过程较琼脂糖胶复杂很多，且具有更大的毒性，其存在电泳及银染过程耗时较多，且稳定性较差、不易重复等弊端。如上所述，显性白羽鸡PMEL17基因的突变位点只有9bp碱基的插入，突变型和非突变型基因的序列长度差异很小。目前已报道的检测显性白羽基因的方法中，不论是在PMEL17基因突变位点前后设计引物然后扩增，再通过PAGE法进行鉴别；还是通过两对等位基因特异性引物对样本的PMEL17基因突变位点进行检测，都存在耗时较长，稳定性差等问题，不适用于育种中大量样本的检测。PCR-RFLP方法是基因型检测中得到普遍公认的方法，其特点是稳定性好，可重复，适用于大规模样品检测，该方法的关键是找到或制造特异性的酶切位点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鸡显性白羽基因的鉴定的方法。本专利技术提供了一对用于鉴定鸡显性白羽基因的引物对。本专利技术所提供的专用引物为由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对。含有所述引物对的试剂盒也属于本专利技术的保护范围。为了方便检测，所述试剂盒中还含有限制性内切酶BsrB I。在本专利技术的一个实施例中，所述试剂盒中含有如下组分：所述引物对、所述限制性内切酶BsrB I（NEB公司产品）、2×Taq PCR masterMix（北京汇天东方科技有限公司，产品编号HT201）、ddH2O、10×NEBuffer（与所述限制性内切酶BsrB I配套使用的缓冲液，NEB公司，产品编号#B7004S）、浓度为2.5mM的Mg2+水溶液（如MgCl2）。所述引物对或所述试剂盒可用于鉴定或辅助鉴定待测鸡的显性白羽基因的基因型；所述显性白羽基因的基因型为如下三种中的任一种：（a1）II基因型：显性白羽纯合（表型白羽）；（a2）Ii基因型：显性白羽杂合（表型白羽）；（a3）ii基因型：非显性白羽纯合（表型可为有色羽，也可为白羽）。所述试剂盒的制备方法也属于本专利技术的保护范围。根据所述试剂盒中含有组分的不同，所述试剂盒的制备方法具体可包括如下（c）或（d）的步骤：（c）将所述引物对中的两条单链DNA分别单独包装；（d）将所述引物对中的两条单链DNA和所述限制性内切酶BsrB I分别单独包装。本专利技术所提供的鉴定或辅助鉴定鸡显性白羽基因的基因型的方法，是检测待测鸡的显性白羽基因的基因型为如下三种中的哪一种：（a1）II基因型：显性白羽纯合（表型白羽），（a2）Ii基因型：显性白羽杂合（表型白羽），（a3）ii基因型：非显性白羽纯合（表型可为有色羽，也可为白羽），可为如下（A）或（B）：（A）具体可包括如下（A1）和（A2）的步骤：（A1）以待测鸡的基因组DNA为模板，用所述引物对（序列3和序列4）进行PCR扩增，得到PCR产物；（A2）用限制性内切酶BsrB I酶切步骤（A1）所得PCR产物，根据酶切结果按照如下方法确定所述待测鸡的显性白羽基因的基因型：若酶切产物为184bp和42bp的两个DNA片段，则所述待测鸡为或候选为II基因型；若酶切产物为184bp、42bp和217bp的三个DNA片段，则所述待测鸡为或候选为Ii基因型；若酶产物为217bp的一个DNA片段，则所述待测鸡为或候选为ii基因型。（B）具体可包括如下步骤：（B1）检测待测鸡的基因组DNA中是否含有序列表中序列1和序列2所示DNA片段；（B2）根据步骤（B1）的检测结果按照如下方法确定所述待测鸡的显性白羽基因的基因型：若所述待测鸡的基因组DNA中含有序列2所示的DNA片段，同时不含有序列1所示的DNA片段，则所述待测鸡为或候选为II基因型；若所述待测鸡的基因组DNA中同时含有序列1和序列2所示的DNA片段，则所述待测鸡为或候选为Ii基因型；若所述待测鸡的基因组DNA中含有序列1所示的DNA片段，同时不含有序列2所示的DNA片段，则所述待测鸡为或候选为ii基因型。在所述鉴定或辅助鉴定鸡显性白羽基因的基因型的方法中，（B）的步骤（B1）中，所述“检测待测鸡的基因组DNA中是否含有序列表中序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
引物对，由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成。

【技术特征摘要】
1.引物对，由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成。
2.含有权利要求1所述引物对的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有限制性内
切酶BsrB I。
4.权利要求1所述的引物对或权利要求2或3所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定
待测鸡的显性白羽基因的基因型中的应用；所述显性白羽基因的基因型为如下三种中
的任一种：
（a1）II基因型：显性白羽纯合；
（a2）Ii基因型：显性白羽杂合；
（a3）ii基因型：非显性白羽纯合。
5.权利要求2或3所述试剂盒的制备方法，包括如下（a）或（b）的步骤：
（a）将所述引物对中的两条单链DNA分别单独包装；
（b）将所述引物对中的两条单链DNA和所述限制性内切酶BsrB I分别单独包装。
6.鉴定或辅助鉴定鸡显性白羽基因的基因型的方法，是检测待测鸡的显性白羽
基因的基因型为如下三种中的哪一种：（a1）II基因型：显性白羽纯合，（a2）Ii基因
型：显性白羽杂合，（a3）ii基因型：非显性白羽纯合，其特征在于：所述方法包括如
下（A1）和（A2）的步骤：
（A1）以待测鸡的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，
得到PCR产物；
（A2）用限制性内切酶BsrB I酶切步骤（A1）所得PCR产物，根据酶切结果按
照如下方法确定所述待测鸡的显性白羽基因的基因型：若酶切产物为184bp和42bp
的两个DNA片段，则所述待测鸡为或候选为II基因型；若酶切产物为184bp、42bp
和217bp的三个DNA片段，则所述待测鸡为或候选为Ii基因型；若酶产物为217bp
的一个DNA片段，...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓学梅，赵妤娟，张熙悦，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11