一种重组猪圆环病毒病毒样颗粒及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种重组猪圆环病毒病毒样颗粒及其制备方法，首次实现了在基因工程细胞内部表达形成猪圆环病毒病毒样颗粒(VLP)，实验结果表明，该重组猪圆环病毒病毒样颗粒能够特异性地与抗猪圆环病毒抗体结合，且能够诱发动物体产生抗猪圆环病毒的免疫反应。

【技术实现步骤摘要】
一种重组猪圆环病毒病毒样颗粒及其制备方法
本专利技术属于生物工程领域，公开了一种重组猪圆环病毒病毒样颗粒及其制备方法。
技术介绍
巴斯德毕赤酵母作为一种宿主菌，其表达系统由于具有表达量高、本身遗传稳定、具翻译后加工能力等自身优势，实质越来越受到关注，其研究和商业价值也不断体现。巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白分胞内的表达和分泌到胞外两种方式。分泌表达的蛋白在培养基中会被自身分泌的蛋白酶降解，由于甲醇酵母多采用高密度发酵，蛋白酶也会随着细胞密度的增高而增高。此外，该分泌表达系统发酵周期较长，易污染，且长时间的发酵不利于外源蛋白的表达。因此，促进重组蛋白的胞内表达并缩短发酵周期具有很重要的工业意义。病毒样颗粒(VirusLikeParticles，VLP)是含有病毒一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒核酸(DNA/RNA)，不能自主复制，其在形态上与真正的病毒粒子相同或相似，可通过与病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应。由于VLPs没有感染性，作为免疫原，它可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应，而宿主、病毒和疫苗因素共同决定VLPs产生的机体防护水平。目前活病毒疫苗的缺陷就是一旦病毒活性恢复，安全性不能保证。同时，灭活病毒疫苗可因灭活过程不完全而导致安全性问题。但VLPs疫苗没有感染性，稳定性好，不易失活，具有广阔的发展前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种重组猪圆环病毒病毒样颗粒及其制备方法。本专利技术的第一方面，提供了一种基因工程细胞，所述基因工程细胞为真核细胞，并且所述细胞的基因组中整合有猪圆环病毒外壳蛋白的表达盒；或者所述细胞中含有表达载体，所述表达载体含有所述猪圆环病毒外壳蛋白的表达盒；并且所述基因工程细胞在胞内表达所述外壳蛋白，且所述外壳蛋白在所述基因工程细胞内部形成病毒样颗粒(VLP)。在另一优选例中，所述病毒为猪圆环病毒，优选地为猪圆环病毒2型。在另一优选例中，所述病毒样颗粒为猪圆环病毒2型Cap蛋白形成的病毒样颗粒。在另一优选例中，所述细胞为酵母细胞，优选为毕赤酵母细胞，更优选为毕赤酵母KM71菌株。在另一优选例中，所述的表达盒包括5'至3'可操作地连接的以下元件：启动子、起始密码子、所述外壳蛋白的ORF序列和终止密码子。在另一优选例中，所述的起始密码子和所述外壳蛋白的ORF序列直接相连。在另一优选例中，所述的表达盒不含有分泌表达元件。在另一优选例中，所述的表达盒不含有分泌肽、引导肽、或信号肽。在另一优选例中，所述外壳蛋白基因为猪圆环病毒ORF2抗原基因。在另一优选例中，所述猪圆环病毒ORF2抗原基因序列如SEQIDNO.:1所示(含起始密码子和终止密码子)。在另一优选例中，所述表达载体以毕赤酵母pPICX载体为骨架。本专利技术的第二方面，提供了一种病毒样颗粒(VLP)，所述VLP由本专利技术第一方面所述的基因工程细胞表达。本专利技术的第三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本专利技术第二方面所述的病毒样颗粒，和药学上可以接受的载体。在另一优选例中，所述药物组合物包括疫苗组合物。本专利技术的第四方面，提供了一种制备VLP的方法，包括步骤：在适合表达的条件下，培养本专利技术第一方面所述的细胞，从而表达出本专利技术第二方面所述的病毒样颗粒(VLP)；和分离所述病毒样颗粒(VLP)。本专利技术的第五方面，提供了一种分离的经密码子优化的多核苷酸，所述多核苷酸编码SEQIDNO.:2所示的多肽；并且所述多核苷酸选自下组：(a)序列如SEQIDNO.:1所示的多核苷酸；(b)核苷酸序列与SEQIDNO.:1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；(c)如SEQIDNO.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；(e)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。本专利技术的第六方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本专利技术第五方面所述的多核苷酸。本专利技术的第七方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本专利技术第六方面所述的表达载体，或者在基因组中整合有本专利技术第五方面所述的多核苷酸。本专利技术的第八方面，提供了一种药物组合物，所述的组合物含有本专利技术第二方面所述的病毒样颗粒(VLP)、本专利技术第五方面所述的多核苷酸或者本专利技术第六方面所述的表达载体或者本专利技术第七方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或辅料。在另一优选例中，所述药物组合物包括疫苗组合物。在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。在另一优选例中，所述的佐剂包括氧化铝、皂苷、quilA、胞壁酰二肽、矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、细胞因子(包括IL-1、IL-2、IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12、和CpG)。本专利技术的第九方面，提供了一种分离的重组多肽，所述重组多肽中具有猪圆环病毒Cap蛋白的氨基酸序列，并且所述重组多肽被包装为病毒样颗粒。在另一优选例中，所述的重组多肽由本专利技术第一方面所述的基因工程细胞表达。在另一优选例中，所述重组多肽具有如SEQIDNO.:2所示的氨基酸序列。在另一优选例中，所述重组多肽具有以下特性：(1)能够特异性地与抗猪圆环病毒抗体结合；和/或(2)能够诱发动物体产生针对猪圆环病毒的免疫反应。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了PCVCAPS基因的核苷酸及编码的氨基酸序列。图2显示了Westernblot检测PCV2cap蛋白在毕赤酵母中的表达。图3显示了ELISA检测标准曲线图。图4显示了PCV2VLPOptiprep密度梯度离心的结果。图5显示了电镜负染实验观察PCV2病毒颗粒。图6显示了VLP免疫小鼠后血清IPMA结果，其中图A、图B为阳性结果，图C为阴性结果。具体实施方式本专利技术人通过广泛而深入的研究，获得一种重组猪圆环病毒病毒样颗粒，首次实现了在基因工程细胞内部表达形成猪圆环病毒病毒样颗粒(VLP)，实验结果表明，该重组猪圆环病毒病毒样颗粒能够特异性地与抗猪圆环病毒抗体结合，且能够诱发动物体产生抗猪圆环病毒的免疫反应。本专利技术还提供了上述重组猪圆环病毒病毒样颗粒的制备方法。猪圆环病毒本专利技术选取猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白VLPs为报告蛋白。PCV2的感染与断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的发生密切相关，其感染呈世界性分布，已成为危害养猪业健康发展的重要原因之一。而且由于疫苗抗原的制备成本居高不下，导致市场供应的各种PCV2疫苗单头份价格在8～48元人民币之间，高昂的疫苗价格严重制约了PCV2疫苗的推广使用。因此，本专利技术提供的VLPs疫苗能够在动物病毒性传染病毒控制工作中发挥了巨大的作用，对PMWS的防治及养猪业的发展有重要的战略和现实意义。优选地，本专利技术的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白VLPs的氨基酸序列如下：MTYPRRRYRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTFGYTVKATTVRTPSWAVDMMR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因工程细胞，其特征在于，所述基因工程细胞为真核细胞，并且所述细胞的基因组中整合有猪圆环病毒外壳蛋白的表达盒；或者所述细胞中含有表达载体，所述表达载体含有所述猪圆环病毒外壳蛋白的表达盒；并且所述基因工程细胞在胞内表达所述外壳蛋白，且所述外壳蛋白在所述基因工程细胞内部形成病毒样颗粒(VLP)。

【技术特征摘要】
1.一种基因工程细胞，其特征在于，所述基因工程细胞为毕赤酵母细胞，并且所述细胞的基因组中整合有猪圆环病毒外壳蛋白的表达盒；或者所述细胞中含有表达载体，所述表达载体含有所述猪圆环病毒外壳蛋白的表达盒；并且所述基因工程细胞在胞内表达所述外壳蛋白，且所述外壳蛋白在所述基因工程细胞内部形成病毒样颗粒；并且所述的表达盒不含有分泌表达元件；和所述外壳蛋白基因为序列如SEQIDNO.:1所示的猪圆环病毒ORF2抗原基因。2.如权利要求1所述的基因工程细胞，其特征在于，所述细胞为毕赤酵母KM71菌株。3.如权利要求1所述的基因工程细胞，其特征在于，所述的表达盒包括5'至3'可操作地连接的以下元件：启动子、起始密码子、所述外壳蛋白的ORF序列和终...

【专利技术属性】
技术研发人员：楼觉人，尹曼曼，孙芬芬，王振华，赵运霞，刘红明，王东，周项，
申请(专利权)人：上海海利生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31