一株生产苯酚的重组菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株生产苯酚的重组菌株及其应用，本发明专利技术提供了重组菌1，为将编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因导入大肠杆菌中得到的重组菌1。上述重组菌1为如下重组菌1-1或重组菌1-2：所述重组菌1-1为将所述编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因及其人工调控元件M1-12整合到大肠杆菌基因组中得到的重组菌1-1；所述重组菌1-2为将所述编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因通过重组载体导入大肠杆菌得到的重组菌1-2。本发明专利技术公开的菌株具有一个新的苯酚合成途径，可用于生物发酵法生产苯酚，生物发酵法生产苯酚相对于化学合成法更加绿色环保，具有很高的生产应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一株生产苯酚的重组菌株及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一株生产苯酚的重组菌株及其应用。
技术介绍
苯酚(phenol)，又称石炭酸、羟基苯，是一种非常重要的有机化工原料。在石油化工领域，苯酚常用来生产酚醛树脂、己内酰胺、双酚A、己二酸、水杨醛、苦味酸、烷基酚、苯胺、五氯酚等化工产品及中间体；在生物医药领域，苯酚常作为杀菌剂、防腐剂以及生产药物(如阿司匹林)的重要原料等。近些年来，随着生物、医药、化工等行业的飞速发展，国内外对苯酚及其下游产品的需求呈逐年上升的趋势。预计到2015年，我国的苯酚市场需求将达到174.3万吨。而即使在建的苯酚生产项目全部投产，按90％的开工率计算，苯酚的生产能力才151.6万吨。由此可见，我国苯酚产量仍不能满足消费需求，大力发展苯酚项目，仍有广阔的市场前景。目前，国内外生产苯酚的方法主要是化学合成法，包括异丙苯法、甲苯-苯甲酸法、苯氧化法和苯磺化法等。其中，异丙苯法在苯酚生产中占据主导地位，是目前较为成熟的工艺。据统计，截止2010年，全球近97％的苯酚是由异丙苯法生产的。异丙苯法生产苯酚的工艺是以苯和丙烯为原料，在催化剂的作用下，通过加成反应和烷基化反应，生成异丙苯；然后，异丙苯经氧气氧化成过氧化氢异丙苯(CHP)；CHP在硫酸作为催化剂的条件下，分解生产苯酚和丙酮。异丙苯法生产苯酚固然存在工艺成熟、经济性较好等优点，但是其生产工艺特点决定了苯酚生产过程是在较高的温度、一定的压力下进行，而且生产原料和中间产物大部分为易燃、易爆，有毒、有害的危险化学品，造成严重的环境问题和人身安全问题。随着社会的不断发展，崇尚低碳环保、绿色生产的观念日益增强。低能耗、低污染、安全性高的苯酚生产方式逐渐成为科学家们研究的热点。绿色、环保法合成苯酚的早期实施案例是一种半生物合成技术。这种技术首先以葡萄糖为原料，通过微生物发酵法生产莽草酸；然后通过超(近)临界水氧化技术将莽草酸转化为苯酚(Gibsonetal.,2001)。随后，Wierckx等人克隆了来源于Pantoeaagglomerans的酪氨酸裂解酶(TPL)，在PseudomonasputidaS12菌株中构建了完整的苯酚生物合成途径(Wierckxetal.,2005)。由于充足的前体物质酪氨酸的供给是苯酚合成的限制因素，他们过表达了编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合酶的基因aroF-1来提高酪氨酸的供给。然后通过NTG诱变结合高通量筛选来提高苯酚产量(vandenBergetal.,2008；Wierckxetal.,2009；Wierckxetal.,2008)。最后，使用辛醇作为有毒代谢产物苯酚的萃取剂进行双相发酵，使得苯酚产量进一步提高到0.86g/L。最近，Kim等人克隆了来源于Pasteurellamultocida36950的酪氨酸裂解酶，在大肠杆菌中构建了同样的苯酚生物合成途径。他们采用sRNA技术对苯酚生物合成途径中的基因进行调控，得到一株高产苯酚的菌株。最后，使用三丁酸甘油酯作为萃取溶剂进行双相发酵，进一步使苯酚产量提高到3.79g/L(Kimetal.,2014)。4-羟基苯甲酸(pHBA)脱羧基可以生成苯酚。催化这个反应的4-羟基苯甲酸脱羧酶存在于一些微生物中，如Cryptanaerobacterphenolicus(Juteauetal.,2005),Enterobactercloacae(Valkovaetal.,2001),E.coliC2(Chamkhaetal.,2002)和Klebsiellaaerogenes(GrantandPatel,1969)。4-羟基苯甲酸脱羧酶已相继被纯化出来，相关的酶学性质也已被研究的比较透彻(Chowetal.,1999；Liuetal.,2007；Lupaetal.,2005；Lupaetal.,2008；Matsuietal.,2006)。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种重组菌1。本专利技术提供的重组菌1，为如下重组菌1-1或重组菌1-2：所述重组菌1-1为在目的大肠杆菌中表达编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因及其人工调控元件M1-12得到的重组菌；所述重组菌1-2为在目的大肠杆菌中表达编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因得到的重组菌；所述4-羟基苯甲酸脱羧酶由亚基A、亚基B和亚基C组成；所述亚基A的氨基酸序列为序列表中序列11；所述亚基B的氨基酸序列为序列表中序列12；所述亚基C的氨基酸序列为序列表中序列13；所述人工调控元件M1-12的核苷酸序列为序列表中序列7。上述重组菌1-1(Phe002)按照包括如下步骤的方法制备：将所述编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因及其人工调控元件M1-12整合到目的大肠杆菌基因组中，得到重组菌1-1；Phe002具体为将含有与乳酸脱氢酶基因ldhA上游同源的50bp序列、FRT-Km-FRT片段、编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因(ycl操纵子)及其人工调控元件M1-12和与ldhA基因下游同源的60bp序列的DNA片段(实施例2的(一)一的1制备)导入的大肠杆菌ATCC8739中，同源重组，得到Phe001；再将质粒pFT-A转入Phe001中，去除Km-FRT序列，得到Phe002。所述重组菌1-2(8739-ycl)按照包括如下步骤的方法制备：将所述编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因通过重组载体导入目的大肠杆菌，得到重组菌1-2。上述重组载体具体可为99AM-ECycl。上述重组菌中，所述4-羟基苯甲酸脱羧酶来源于大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌；所述编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因的核苷酸序列具体为序列表中序列1(来源于大肠杆菌)或序列2(枯草芽孢杆菌)。本专利技术的另一个目的是提供重组菌2。本专利技术提供的重组菌2，为如下重组菌2-1或重组菌2-2：所述重组菌2-1为在将编码DAHP合酶突变体基因及其人工调控元件M1-46替换上述的重组菌1-1基因组中的DAHP合酶基因及其调控元件得到的重组菌1；所述重组菌2-2为在目的大肠杆菌中表达编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因和编码DAHP合酶突变体基因得到的重组菌2；所述人工调控元件M1-12的核苷酸序列为序列表中序列7；所述人工调控元件M1-46的核苷酸序列为序列表中序列9；所述编码DAHP合酶突变体基因的核苷酸序列为序列表中序列4。重组菌2-1(Phe004)为将aroGfbr基因替换重组菌1-1(Phe002菌株)基因组中的aroG基因，且将人工调控元件M1-46替换重组菌1-1(Phe002菌株)基因组中的aroG基因的原始调控元件得到的重组菌，具体如下：1)将含有与aroG基因上游同源50bp、下游同源的100bp序列、FRT-Km-FRT片段、人工调控元件M1-12和aroGfbr基因的前552bp片段(实施例2的(二)的二)导入的Phe002菌株中，同源重组，得到Phe003；2)将含有与aroG基因上游同源的50bp序列、catsacB基因簇和与aroG基因ATG下游同源的50bp序列的DNA片段(实施例2的(二)的三的1)转入含有pKD46的Phe003，得到中间菌；再将含有与aroG基因上游同源的50bp序列、人工调控元件M1-46和与aroG基因ATG下游同源的5本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组菌1，为如下重组菌1‑1或重组菌1‑2：所述重组菌1‑1为在目的大肠杆菌中表达编码4‑羟基苯甲酸脱羧酶基因及其人工调控元件M1‑12得到的重组菌；所述重组菌1‑2为在目的大肠杆菌中表达编码4‑羟基苯甲酸脱羧酶基因得到的重组菌；所述4‑羟基苯甲酸脱羧酶由亚基A、亚基B和亚基C组成；所述亚基A的氨基酸序列为序列表中序列11；所述亚基B的氨基酸序列为序列表中序列12；所述亚基C的氨基酸序列为序列表中序列13；所述人工调控元件M1‑12的核苷酸序列为序列表中序列7。

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）Phe009，其保藏号为CGMCCNo.103...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学礼，李清艳，苗良田，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12