一种基于水凝胶微孔板的细胞球原位制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于水凝胶微孔板的细胞球原位制备方法，属于生物医学技术领域。本发明专利技术方法先制备疏水基片和载细胞的微尺度水凝胶模板，通过倒模的方式制备水凝胶微孔板，在培养箱中进行细胞培养原位形成细胞球。本发明专利技术中使用载细胞的微尺度水凝胶作为构建带有球面微孔的水凝胶微孔板，无需后续人为进行细胞接种，孔内细胞密度可控，易于构建大小可控、形状规则的细胞球。本方法成本低、操作简单、可重复性好、适用范围广，在组织工程和再生医学以及药物筛选等领域中具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于水凝胶微孔板的细胞球原位制备方法
本专利技术属于生物医学
，涉及细胞球的制备方法，具体涉及一种基于水凝胶微孔板的细胞球原位制备方法。
技术介绍
细胞球是一种多细胞聚集体，与二维细胞培养体系相比，细胞球培养能够更好地模拟在体微环境，获得与在体更为相近的响应结果，因此，在病理机理、药物筛选以及组织工程中具有广阔的应用前景。构建细胞球有多种方法，如基于细胞非粘附表面的微孔板法、基于重力的悬挂液滴法、基于磁力的磁悬浮法以及基于离心力的旋转培养法等。其中，微孔板法因其操作简单、可控性好、实现起来较为容易，得到了广泛的应用。微孔板法的基本原理是利用微孔结构的空间约束和微孔板材料的细胞非粘附特性，促进细胞在生长过程中通过细胞之间的粘附力聚集成球。制备微孔板常用的材料是聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)，PDMS是目前微流控芯片领域用的最多的材料，成本低、惰性好、具有疏水性、无毒。制备PDMS微孔板常用的是模具法。模具材料通常采用硅或金属材料。但是硅和金属模具加工过程较为复杂，成本也较高，并且每次使用后清洗困难，重复使用效果差。水凝胶是一种含有大量水的高分子聚合物网络，因其生物相容性、可降解性以及与细胞外基质相似等特性，在组织工程和再生医学领域得到了广泛的应用。近些年来，基于琼脂糖、海藻酸盐以及聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)水凝胶的微孔板在细胞球培养方面也得到了发展。目前水凝胶微孔板中微孔结构多半是圆柱状，底面是平的，形成的细胞球的尺寸和形状差异较大。最近研究表明，凹状微孔(如球面微孔)能够更好地促进细胞聚集生长后形成尺寸均一、形状规则的细胞球。但是，目前缺少一种有效的在水凝胶表面构建球面微孔的方法；并且，目前研究都是在构建微孔板后再人为种植细胞，存在效率低、种植细胞密度不均匀以及培养成球过程中细胞容易流失等问题。
技术实现思路
为了克服上述现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种基于水凝胶微孔板的细胞球原位制备方法，该方法操作简单、成本低、适用范围广、成形效果好。本专利技术是通过以下技术方案来实现：一种基于水凝胶微孔板的细胞球原位制备方法，包括以下步骤：1)将基片进行疏水处理，制得疏水基片；2)将培养的细胞消化，然后与第一水凝胶溶胶混合，制成第一水凝胶溶胶细胞混合液；其中，第一水凝胶溶胶为质量浓度3％～20％的明胶或甲基丙烯酸酰化明胶；3)将第一水凝胶溶胶细胞混合液以0.05～2μL每液滴的形式沉积至步骤1)制得的疏水基片表面，形成半球状液滴，在0～20℃下静置至半球状液滴交联固化，制得载细胞的微尺度水凝胶模板；4)在载细胞的微尺度水凝胶模板上方覆盖第二水凝胶溶胶，然后通过低温处理或紫外照射使第二水凝胶溶胶交联，形成第二水凝胶微孔板和载细胞的微尺度水凝胶模板复合结构；其中，第二水凝胶溶胶为质量浓度1％～5％的琼脂糖，或者为质量浓度5％～20％的聚乙二醇水凝胶及聚乙二醇水凝胶衍生物；5)将第二水凝胶微孔板和载细胞的微尺度水凝胶模板复合结构置于培养皿中，加入培养液后进行培养，直至第一水凝胶融化为溶胶，在此培养过程中，细胞在第二水凝胶微孔板的微孔中生长，形成细胞球。步骤1)所述疏水处理具体为：将基片浸泡在疏水剂中处理后，烘干；所述疏水剂为子西莱自清洁剂；或者，将基片进行硅烷化处理；或者，将聚四氟乙烯薄膜贴在基片上，制得疏水表面。所述基片为玻璃基片或聚甲基丙烯酸甲酯基片。步骤3)是采用移液枪、注射器或细胞打印平台将步骤2)得到的第一水凝胶溶胶细胞混合液沉积到步骤1)制备的疏水基片表面形成半球状液滴。步骤3)所述的静置时间为10～60min。步骤4)所述的低温处理是在0～20℃下静置5～30min。步骤4)所述的紫外照射处理时间为10～120s。步骤5)所述的培养是将加入培养液的培养皿置于37℃、二氧化碳浓度为5％的培养箱中进行培养1～14d。步骤2)所述的培养的细胞为乳腺癌细胞MCF–7、造骨细胞、骨髓基质细胞、肝细胞、成纤维细胞、心肌细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、脂肪干细胞或神经前体细胞。步骤2)所述的第一水凝胶溶胶细胞混合液中细胞浓度为0.01×107～5×107个/mL。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：本专利技术基于水凝胶微孔板构建的细胞球原位制备方法，首先制备第一水凝胶溶胶细胞混合液，将第一水凝胶溶胶细胞混合液沉积在疏水基片上制得载细胞的微尺度水凝胶模板，再在载细胞的微尺度水凝胶模板上方覆盖第二水凝胶溶胶，使第二水凝胶溶胶交联后，形成第二水凝胶微孔板和载细胞的微尺度水凝胶模板复合结构，最后将第二水凝胶微孔板和载细胞的微尺度水凝胶模板复合结构在培养箱中进行细胞球的培养，第一水凝胶融化为溶胶，在此培养过程中，细胞在第二水凝胶微孔板的孔中生长，形成细胞球。本专利技术创新性地使用载细胞的微尺度水凝胶作为模板构建带有球面微孔的第二水凝胶微孔板，在细胞培养温度下，第一水凝胶转化为溶胶态，预先混合的细胞在第二水凝胶微孔板的微孔中原位生长增殖形成细胞球，无需后续人为进行细胞接种，孔内初始细胞密度可控。本专利技术方法易于构建大小可控、形状规则的细胞球，且成本低、操作简单、可重复性好、适用范围广，在组织工程和再生医学以及药物筛选等领域中具有广阔的应用前景。附图说明图1为本专利技术基于水凝胶微孔板的细胞球原位制备方法的实验操作流程图；图2a为微尺度水凝胶模板照片；图2b为利用微尺度水凝胶模板倒模形成的PEG-DMA水凝胶微孔阵列照片；图2c为不同体积液滴的俯视图；图2d为为不同尺寸微孔俯视图；图2e为微尺度水凝胶模板中0.48μL和0.23μL液滴的侧面图；图2f为体积为0.48μL和0.23μL的水凝胶模板倒模形成的水凝胶微孔剖面图；图3a为MCF-7在细胞密度1×106个/mL和0.48μL微尺度水凝胶模板倒模形成的水凝胶微孔中分别培养1小时、3天、5天和7天的相差照片；图3b为图3a培养7天后的荧光染色照片；图3c为MCF-7在细胞密度1×106个/mL和0.23μL微尺度水凝胶模板倒模形成的水凝胶微孔中分别培养1小时、3天、5天和7天的相差照片；图3d为图3c培养7天后的荧光染色照片；图3e为MCF-7在细胞密度5×105个/mL和0.48μL微尺度水凝胶模板倒模形成的水凝胶微孔中培养7天后的相差图片；图3f为图3e的荧光染色照片；图3g为MCF-7在细胞密度5×105个/mL和0.23μL微尺度水凝胶模板倒模形成的水凝胶微孔中培养7天后的相差图片；图3h为图3g的荧光染色照片；图4为细胞在培养和成球过程中存活率柱状图。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。本专利技术公开的一种基于水凝胶微孔板的细胞球原位制备方法，采取的技术方案如图1流程所示：第一步，准备疏水基片：将载玻片或聚甲基丙烯酸甲酯[poly(methylmethacrylate)，PMMA]片材进行硅烷化处理或浸泡在疏水剂中，进行疏水处理后，烘干备用，疏水剂为子西莱自清洁剂；或将聚四氟乙烯(PTFE)薄膜贴在基底(载玻片、聚甲基丙烯酸甲酯或培养皿盖内表面等)上，制造疏水表面。第二步，制备第一水凝胶溶胶和细胞悬液的混合液：消化事先培养的细胞，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于水凝胶微孔板的细胞球原位制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将基片进行疏水处理，制得疏水基片；2)将培养的细胞消化，然后与第一水凝胶溶胶混合，制成第一水凝胶溶胶细胞混合液；其中，第一水凝胶溶胶为质量浓度3％～20％的明胶或甲基丙烯酸酰化明胶；3)将第一水凝胶溶胶细胞混合液以0.05～2μL每液滴的形式沉积至步骤1)制得的疏水基片表面，形成半球状液滴，在0～20℃下静置至半球状液滴交联固化，制得载细胞的微尺度水凝胶模板；4)在载细胞的微尺度水凝胶模板上方覆盖第二水凝胶溶胶，然后通过低温处理或紫外照射使第二水凝胶溶胶交联，形成第二水凝胶微孔板和载细胞的微尺度水凝胶模板复合结构；其中，第二水凝胶溶胶为质量浓度1％～5％的琼脂糖，或者为质量浓度5％～20％的聚乙二醇水凝胶及聚乙二醇水凝胶衍生物；5)将第二水凝胶微孔板和载细胞的微尺度水凝胶模板复合结构置于培养皿中，加入培养液后进行培养，直至第一水凝胶融化为溶胶，在此培养过程中，细胞在第二水凝胶微孔板的微孔中生长，形成细胞球。

【技术特征摘要】
1.一种基于水凝胶微孔板的细胞球原位制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将基片进行疏水处理，制得疏水基片；2)将培养的细胞消化，然后与第一水凝胶溶胶混合，制成第一水凝胶溶胶细胞混合液；其中，第一水凝胶溶胶为质量浓度3％～5％的明胶或甲基丙烯酸酰化明胶；3)将第一水凝胶溶胶细胞混合液以0.05～2μL每液滴的形式沉积至步骤1)制得的疏水基片表面，形成半球状液滴，在0～20℃下静置至半球状液滴交联固化，制得载细胞的微尺度水凝胶模板；4)在载细胞的微尺度水凝胶模板上方覆盖第二水凝胶溶胶，然后通过低温处理或紫外照射使第二水凝胶溶胶交联，形成第二水凝胶微孔板和载细胞的微尺度水凝胶模板复合结构；其中，第二水凝胶溶胶为质量浓度1％～5％的琼脂糖，或者为质量浓度5％～20％的聚乙二醇水凝胶及聚乙二醇水凝胶衍生物；5)将第二水凝胶微孔板和载细胞的微尺度水凝胶模板复合结构置于培养皿中，加入培养液后进行培养，直至第一水凝胶融化为溶胶，在此培养过程中，细胞在第二水凝胶微孔板的微孔中生长，形成细胞球。2.根据权利要求1所述的一种基于水凝胶微孔板的细胞球原位制备方法，其特征在于，步骤1)所述疏水处理具体为：将基片浸泡在疏水剂中处理后，烘干；所述疏水剂为子西莱自清洁剂；或者，将基片进行硅烷化处理；或者，将聚四氟乙烯薄膜贴在基片上，制得疏水表面。3.根据权利要求1或2所述的一种基于水凝胶微孔板的细胞球原位制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐峰，黄国友，凌楷，卢天健，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61