【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本专利申请要求2012年8月6日提交的美国临时专利申请No.61/680,057和2012年8月8日提交的美国临时专利申请No.61/681,071的申请日的优先权,所述专利申请的公开内容以引用方式并入本文。
技术介绍
哌珀霉素是在多种子囊菌纲(Ascomycete)真菌细胞中通过非核糖体肽合成酶(NRPS)产生的线状肽类抗生素。哌珀霉素的长度通常小于20个残基,具有C端醇残基、非标准氨基酸残基,包括α-氨基异丁酸(Aib)和异缬氨酸(Iva)以及亚氨基酸、羟基脯氨酸(Hyp)。已知木霉属(Trichoderma)(有性型肉座菌属(Hypocrea))及相关属产生大量的哌珀霉素,已显示哌珀霉素具有抗细菌、抗真菌、以及甚至抗癌特性。具体地讲,里氏木霉(T.reesei)、深绿木霉(T.atroviride)和绿木霉(T.virens)产生11个和14个残基的哌珀霉素,其可用作管理植物病原体的生物控制剂。哌珀霉素是由在与液体培养基相对而言的固体培养基上生长的子囊菌属(Ascomycete spp.)真菌细胞产生的,并且迄今为止尚未认为其对使用子囊菌纲真菌细胞作为宿主用于在深层(submerged)培养物中产生工业重要性多肽具有重要作用。NRPS是能够酶促组装小肽的蛋白质。NRPS具有模块化组织,其中每个模块由约1100个氨基酸残基组成,其以最小量形成腺苷酰化(A)结构域、巯基化(T)结构域和缩合(C)结构域 ...
【技术保护点】
一种用于在包含不溶性材料的培养基中生长的子囊菌纲(Ascomycete)真菌细胞中产生目的蛋白的方法,包括:在变体子囊菌纲真菌细胞中表达所述目的蛋白,所述真菌细胞包含破坏至少一种非核糖体肽合成酶(NRPS)的基因修饰,其中相对于由等量未修饰的子囊菌纲真菌细胞在包含不溶性材料的培养基中生长时产生的哌珀霉素的量,所述变体细胞产生减小量的哌珀霉素。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.08.06 US 61/680,057;2012.08.08 US 61/681,0711.一种用于在包含不溶性材料的培养基中生长的子囊菌纲(Ascomycete)
真菌细胞中产生目的蛋白的方法,包括:在变体子囊菌纲真菌细胞
中表达所述目的蛋白,所述真菌细胞包含破坏至少一种非核糖体肽
合成酶(NRPS)的基因修饰,其中相对于由等量未修饰的子囊菌纲真
菌细胞在包含不溶性材料的培养基中生长时产生的哌珀霉素的量,
所述变体细胞产生减小量的哌珀霉素。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述包含不溶性材料的培养基包
括以半固体悬浮液形式提供的碳源。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述培养基为生物质
底物。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述用于降低所述哌
珀霉素产生的基因修饰是在不引入外源DNA的情况下破坏至少一种
非核糖体肽合成酶(NRPS)基因。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述用于降低所述哌
珀霉素产生的基因修饰是完全或部分缺失至少一种非核糖体肽合成
酶(NRPS)基因。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述非核糖体肽合成
酶(NRPS)基因是tex1或tex2。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述子囊菌纲真菌细
胞是盘菌亚门(Pezizomycotina)中的丝状真菌细胞。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述子囊菌纲真菌细
胞是木霉属(Trichoderma spp.)细胞。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述子囊菌纲真菌细
胞是里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述目的蛋白是分泌
蛋白。
11.一种用于在子囊菌纲真菌细胞中产生目的蛋白的方法,包括:在变
体子囊菌纲真菌细胞中表达所述目的蛋白,所述真菌细胞包含相对
\t于由等量未修饰的子囊菌纲真菌细胞产生的哌珀霉素的量降低哌珀
霉素产生的基因修饰;其中所述降低的哌珀霉素产生导致:与所述
未修饰的子囊菌纲真菌细胞相比,所述变体子囊菌纲真菌细胞的生
长改善;与在等量未修饰的子囊菌纲真菌细胞存在的情况下生长的
第二微生物生物体的生长相比,在所述变体子囊菌纲真菌细胞存在
的情况下生长的所述第二微生物生物体的生长改善;或者与在由等
量未修饰的子囊菌纲真菌细胞产生的目的蛋白存在的情况下生长的
所述第二微生物生物体的生长相比,在由所述变体子囊菌纲真菌细
胞产生的目的蛋白存在的情况下生长的所述第二微生物生物体的生
长改善。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述变体子囊菌纲真菌细胞在包
含不溶性材料的碳源上生长。
13.根据权利要求11所述的方法,其中所述变体子囊菌纲真菌细胞在以
半固体悬浮液形式提供的碳源上生长。
14.根据前述权利要求11-13中任一项所述的方法,其中所述用于降低所
述哌珀霉素产生的基因修饰是降低至少一种非核糖体肽合成酶
(NRPS)产生的基因修饰。
15.根据前述权利要求11-14中任一项所述的方法,其中所述用于降低所
述哌珀霉素产生的基因修饰是破坏至少一种非核糖体肽合成酶
(NRPS)基因。
16.根据前述权利要求11-15中任一项所述的方法,其中所述用于降低所
述哌珀霉素产生的基因修饰是在不引入外源DNA的情况下破坏至少
一种非核糖体肽合成酶(NRPS)基因。
17.根据前述权利要求11-16中任一项所述的方法,其中所述用于降低所
述哌珀霉素产生的基因修饰是完全或部分缺失至少一种非核糖体肽
合成酶(NRPS)基因。
18.根据前述权利要求11-17中任一项所述的方法,其中所述非核糖体肽
合成酶(NRPS)基因是tex1或tex2。
19.根据前述权利要求11-18中任一项所述的方法,其中所述子囊菌纲真
菌细胞是盘菌亚门中的丝状真菌细胞。
20.根据前述权利要求11-19中任一项所述的方法,其中所述子囊菌纲真
菌细胞是木霉属细胞。
21.根据前述权利要求11-20中任一项所述的方法,其中所述子囊菌纲真
菌细...
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