本发明专利技术公开了一种树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法和用途，属于含有抗原或抗体的医药配制品。本发明专利技术将带有GPC3基因的质粒与真核表达载体pcDNA-DEST53重组，得到pGFP-GPC3重组质粒，并通过核转染的方式将重组质粒导入未成熟树突状细胞，细胞因子TNF-α促进未成熟的树突状细胞成熟，得到树突状细胞肿瘤疫苗DC-GPC3。将所获得的树突状细胞肿瘤疫苗与CIK细胞共培养后，对高表达GPC3肝癌细胞的杀瘤率、抑瘤率均显著提高，表现出良好的抗肝癌效应，具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及含有抗原或抗体的医药配制品领域，具体是一种树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法和用途。
技术介绍
肝细胞癌(HCC)是全世界最常见的恶性肿瘤之一，具有很高的发病率和死亡率，全球每年约有62万患者被新诊断为HCC。由于中国人群中的慢性乙型肝炎病毒感染率高，使得我国占到了全球每年新发病例的55%，成为全世界肝癌最高发的地区之一。肝移植被认为是一种潜在的肝癌根治性手段，目前其5年总体生存率已达到60~80%。但是，由于移植前潜在的肿瘤微小转移灶、术中肿瘤的种植以及移植后免疫抑制剂的应用，肝癌肝移植术后仍然存在较高的肿瘤复发率，即使是符合米兰标准的肝癌患者移植后肿瘤复发率仍可达10°/『20%，从而严重地制约了肝癌肝移植患者的长期生存。近年来,为探索肝癌的有效治疗手段,免疫治疗在国内外备受关注。免疫治疗的优点在于其特异性的治疗手段，对清除微小的转移灶和隐匿瘤，预防肿瘤的复发和转移有较好的效果。目前肝癌的免疫治疗正成为国内外研究的重点和热点。设计一种免疫治疗策略，降低免疫耐受和肿瘤免疫逃避，并产生持久有效的特异性免疫应答，已成为HCC免疫治疗的方向。特别是以树突状细胞(dendritic cell, DC)为基础的基因免疫治疗已显示出有效临床治疗前景。DC作为目前发现的功能最强的专职抗原呈递细胞(antigen presentingcell, APC)，在激发抗肿瘤免疫中处于中心环节，以DC为核心的肿瘤免疫治疗有效低毒，可以提供简单且安全的方法来诱导抗肿瘤免疫。体外培养获得大量的DC使得利用DC疫苗进行免疫治疗成为可能，而选择合适的肿瘤抗原及装载方式体外构建DC肿瘤疫苗成为DC抗肿瘤免疫治疗的关键。同时，在应用DC肿瘤疫苗时，因肿瘤患者体内存在复杂的免疫抑制限制了疫苗诱导细胞毒性T细胞(CTL)克隆的大量产生，影响治疗效果。因此联合体外诱导的大量特异性免疫效应细胞，将可能更有效地提高抗肿瘤免疫能力。癌胚抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (GPC3)是一种细胞膜表面的硫酸乙酰肝素类蛋白聚糖家族成员，其结构特殊，相对分子量为66 000，通过糖基磷脂酰肌醇锚连接于细胞膜。在调控细胞生长、繁殖、分化、黏附和迁移等生物行为中起着很重要的作用。因其与生长因子及其受体、细胞外基质蛋白、黏附分子、蛋白酶、抗蛋白酶等相互作用，故参与生长发育及肿瘤形成。GPC3在生物体内的分布有明显的组织特异性和组织分化的时相特异性。近年来国内外研究表明，GPC3作为一种分子标志物在HCC的诊断、鉴别诊断方面具有重要临床应用价值。有学者针对GPC3作为肿瘤免疫治疗中的靶点开展了相关研究，认为GPC3具有较强的免疫原性，能刺激机体产生细胞毒性T细胞，在不引起自身免疫的情况下即可起到有效的抗肿瘤免疫作用，研究结果表明GPC3抗体和以细胞为基础的免疫治疗都是有效的治疗策略。以GPC3为分子靶点的研究为肝癌治疗研究提供了新的方向。细胞治疗的核心和关键是通过适当的方法将外源基因导入细胞，并使其得到可控的适量表达。传统的电转染或脂质体介导的转染需要摸索的参数较多，如电压、脉冲时间及应用比例等，核转染技术的参数已经根据不同的细胞种类而预先设定，提高细胞转染的效率，并大大减少了预实验的时间。因此，就转染效率及操作过程而言，核转染是转染DC比较理想的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种含有GPC3基因的DC细胞肿瘤疫苗及其制备方法，以及将该疫苗用于主动免疫治疗高表达GPC3的肝癌细胞。本专利技术是按照一下技术方案实现的。一种树突状细胞肿瘤疫苗，所述树突状细胞肿瘤疫苗包含利用核转染至树突状细胞的PGFP-GPC3重组质粒，并通过细胞因子诱导导入重组质粒后的树突状细胞成熟。所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其包括以下步骤: ①将含有癌胚抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3基因的pD0NR223-GPC3质粒与真核表达载体pcDNA-DEST53重组，构建含有癌胚抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3基因的pGFP_GPC3重组质粒，含有癌胚抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3基因的核酸序列如核酸序列表所示； ②用细胞因子体外诱导培养未成熟树突状细胞； ③采用核转染的技术将PGFP-GPC3重组质粒转染未成熟树突状细胞； ④用细胞因子刺激未成熟树突状细胞成熟。所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其所述步骤②中细胞因子为GM-CSF和IL-4o所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其所述步骤④中细胞因子为TNF-α。所述的树突状细胞肿瘤疫苗在制备肝癌免疫性治疗药物中的应用，树突状细胞肿瘤疫苗与杀伤细胞联合应用治疗肝癌。这样设计的本专利技术，得到树突状细胞肿瘤疫苗(DC-GPC3)与外周血来源CIK细胞共培养后，对高表达GPC3肝癌细胞的杀瘤率、抑瘤率均显著提高，表现出良好的抗肝癌效应，这种生物免疫疗法具有符合生理、低毒和高效的特点，有良好的主动免疫治疗效果，是未来肝癌靶向治疗的发展方向，并应用前景广阔。【附图说明】图1是本专利技术DC-GPC3细胞荧光显微镜观察图； 图2是本专利技术流式细胞仪检测细胞转染效率图； 图3是本专利技术western-blot检测DC中GPC3蛋白表达图； 图4是本专利技术成熟DC表面标志流式细胞图； 图5是本专利技术CIK细胞免疫表型变化图； 图6是本专利技术乳酸脱氢酶法检测效应细胞对HepG2细胞的杀伤活性图； 图7是本专利技术裸鼠移植瘤的肿瘤体积图； 图8是本专利技术裸鼠移植瘤的肿瘤重量图。【具体实施方式】下面结合附图及实施例对本专利技术进行详细说明。—.材料、试剂与仪器 1.1材料、试剂 PD0NR223-GPC3 质粒:购自 Immunosoft 生物公司； pcDNA-DEST53真核表达载体:购自Invitrogen生物公司； 重组酶:购自Invitrogen生物公司； Top 10 E.Col1:购自Merck生物公司； 氨苄青霉素:购自上海生工生物公司； 质粒小提中量试剂盒:购自天根生化科技有限公司； 淋巴细胞分离液:购自天津市灏洋生物制品科技公司； GM-CSF:购自 BD Pharmingen 生物公司； IL-4:购自BD Pharmingen生物公司； 消化液成分:购自GibcoBRL生物公司； Amaxa转染试剂:购自Amaxa公司； TNF- α:购自 BD Pharmingen 生物公司； 兔抗人GPC3:购自Santa Cruz生物公司； β -actin:购自Santa Cruz生物公司； Blotto缓冲液:购自武汉博士德生物工程有限公司； 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG Fe抗体:购自Santa Cruz生物公司； FITC-CD40、FITC-CD80、FITC-CD83、FITC-CD86、FITC- HLA-DR、抗体工作液:购自 BDPharmingen生物公司； 多聚甲醒:购自BD Pharmingen生物公司； 抗⑶3单抗:购自BD Pharmingen生物公司； IL-2:购自BD Pharmingen生物公司； IFN- Y:购自 BD Pharmingen 生物公司； CD3/CD8/CD56 单抗、IgGl:购自 BD Pharmi本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种树突状细胞肿瘤疫苗，其特征在于：所述树突状细胞肿瘤疫苗包含利用核转染至树突状细胞的pGFP‑GPC3重组质粒，并通过细胞因子诱导导入重组质粒后的树突状细胞成熟。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王玉亮，刘涛，穆红，江雁，
申请(专利权)人：天津市第一中心医院，
类型：发明
国别省市：天津;12
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