本发明专利技术提供一种桔青霉毒素-蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成法，采用水溶性1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为偶联剂。桔青霉毒素先进行活化，而后与偶联试剂相互反应，之后与蛋白载体进行偶联，最后经透析纯化得到桔青霉毒素—蛋白载体人工偶联抗原。本发明专利技术方法反应条件温和，能够生产出灵敏度高、特异性强、稳定性好的抗桔青霉毒素单克隆抗体；制备过程简便可行，耗时短，容易规模化生产和推广应用。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种桔青霉毒素--蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成法，采用水溶性1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为偶联剂。桔青霉毒素先进行活化，而后与偶联试剂相互反应，之后与蛋白载体进行偶联，最后经透析纯化得到桔青霉毒素—蛋白载体人工偶联抗原。本专利技术方法反应条件温和，能够生产出灵敏度高、特异性强、稳定性好的抗桔青霉毒素单克隆抗体；制备过程简便可行，耗时短，容易规模化生产和推广应用。【专利说明】
本专利技术涉及一种桔青霉毒素一蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成法。
技术介绍
红曲，泛指红曲菌在米饭或淀粉基质上生长发酵的产品。红曲作为传统的特色发 酵食品，在我国具有悠久的历史，主要产地在福建、台湾等地，被广泛应用于食品发酵剂、食 用色素、食品防腐剂以及食品增香剂的生产。1995年，法国教授Blanc证实红曲中存在桔青 霉毒素，一石惊起千层浪，红曲的安全性问题也引起了全世界的关注。 众所周知，真菌毒素作为产毒真菌分泌产生的次生代谢产物，是一类能够导致人 畜毒害的天然有毒化合物。而桔青霉毒素作为其中的一员，是由青霉属和曲霉属等某些真 菌菌株产生的，尽管它具有良好的抑菌性，能抑制芽孢杆菌、结核分枝杆菌和金黄色葡萄球 菌等革兰氏阳性菌，还能抗某些真菌和原生动物，对革兰氏阴性菌抑制较弱。但它具有很强 的肾脏毒性，以及致畸致癌致突变等作用，鉴于这些特性，近年来桔青霉毒素污染引发的各 类毒害问题，越来越多的吸引了人们的注意。欧洲各国出于食品安全的考虑，将桔青霉毒素 列为必检毒素之一。因此，对可能污染桔青霉毒素的产品进行检测显得非常必要。 目前，桔青霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法（TLC)、高效液相色谱法（HPLC) 和免疫化学方法。其中，TLC方法具有操作简单，不需要复杂精密的仪器设备的优点，但灵 敏度较低，准确度不高；而HPLC对桔青霉毒素的检测也有报道，但其前处理繁琐、仪器设备 昂贵、需要严格的操作环境以及专业的操作人员等限制了该方法在临床检测中的推广和应 用；免疫化学方法主要是酶联免疫检测法，由于它具有较高的灵敏度和特异性、对样品的纯 度要求不高、特别适合于大批量样本的检测，便于推广使用。因此，这一方法近年来被广泛 应用于各种真菌毒素的检测。 抗原和抗体是酶联免疫检测方法的核心部分，若要提高检测方法的灵敏度和特异 性，关键是获得具有高度特异性和亲和力的抗体。桔青霉毒素分子量是250. 3Da，属于小分 子化合物(分子量< l〇〇〇Da)，不具有免疫原性，只具有反应原性。只有将桔青霉毒素与蛋白 载体相互偶联，制成人工完全抗原才能刺激机体引起免疫反应产生相应的抗体。 桔青霉毒素分子结构简单，含有三个活性基团，分别是Cl的活泼氢、C7的羧基以 及C8的羟基。目前报道的桔青霉毒素人工偶联抗原的制备方法主要有活性酯法、甲醛加成 法、羰基二咪唑法和双交联化学合成法，但其过程均较为繁琐，耗时长，个别制备方法免疫 获得的抗体灵敏度低、特异性差，甚至无法获得相应抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种桔青霉毒素一蛋白载体人 工偶联抗原的碳二亚胺合成法。它能够生产出灵敏度高、特异性强的抗桔青霉毒素单克隆 抗体；制备过程简便可行，耗时短，容易规模化生产和推广应用。 本专利技术米用水溶性1-乙基-3- (3_二甲基氛基丙基）-碳二亚胺（EDC)和N-轻 基琥珀酰亚胺（NHS)作为偶联试剂。桔青霉毒素先进行活化，而后与偶联试剂相互反应，之 后与蛋白载体进行偶联，最后经透析纯化得到桔青霉毒素一蛋白载体人工偶联抗原。 具体的制备方法包括以下步骤： 1. 桔青霉毒素的活化预处理以及与偶联试剂相互反应：将I mg桔青霉毒素溶解于1 mL的活化缓冲液（0.1 mol/L MES，0.5 mol/L NaCl，pH6.0)中进行活化预处理，加入偶联试 齐[J (0.4 mg EDC和0.6 mg NHS)，摇匀后，室温避光进行偶联反应15min; 2. 过量EDC的处理：向活化缓冲液中加入1. 4 μ L β -巯基乙醇，中和剩余的过量 EDC ； 3. 蛋白载体的预处理：按照桔青霉毒素与蛋白载体初始摩尔比为10:1 - 50:1称取适 量蛋白载体，溶解于I mL偶联缓冲液(磷酸盐缓冲液，100 mM磷酸钠，150 mM NaCl，pH7. 2) 中； 4. 桔青霉毒素与蛋白载体偶联反应：调整活化缓冲液的pH至7. 0以上，之后与偶联缓 冲液混合，摇匀后，室温避光反应2 h即可； 5. 透析纯化：待反应结束后将反应液取出，以0. OlM pH7. 4的磷酸盐缓冲液为透析液， 4 °C透析48 h，每间隔12 h更换1次透析液，之后收集透析袋内溶液，进行紫外全波长扫 描，计算偶联比，并将偶联产物冷冻干燥后-20 °C保存，得到桔青霉毒素一蛋白载体人工偶 联抗原。 偶联缓冲液即为磷酸盐缓冲液。所用蛋白载体可选用牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥 孔血蓝蛋白、多聚赖氨酸等生物蛋白质。 本专利技术中，以BSA为蛋白载体为例，桔青霉毒素和载体蛋白质偶联制备得到桔青 霉毒素人工偶联抗原的合成路线如下。 【权利要求】1. 一种，其特征在于，通过以 下步骤实现： (1) 桔青霉毒素的活化预处理：将1 mg桔青霉毒素溶解于1 mL的活化缓冲液中，加入 偶联试剂，摇匀后，室温避光进行偶联反应15min ; (2) 过量1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺的处理：向活化缓冲液中加入 1.4 u L ^ 一疏基乙醇，中和剩余的过量I-乙基-3_ (3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺； (3) 蛋白载体的预处理：按照桔青霉毒素与蛋白载体初始摩尔比为10:1 - 50:1称取蛋 白载体，溶解于1 mL偶联缓冲液中； (4) 桔青霉毒素与蛋白载体偶联反应：调整活化缓冲液的pH至7. 0以上，之后与偶联 缓冲液混合，摇匀后，室温避光反应2h ; (5) 透析纯化：待反应结束后将反应液取出，以0. 01M pH7. 4的磷酸盐缓冲液为透析 液，4 °C透析48 h，每间隔12 h更换1次透析液，之后收集透析袋内溶液，进行紫外全波长 扫描，计算偶联比，并将偶联产物冷冻干燥后-20 °C保存，得到桔青霉毒素一蛋白载体人工 偶联抗原。2. 根据权利要求1所述的一种桔青霉毒素-蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成 法，其特征在于，所述的活化缓冲液为0.1 mol/L 2- (N-吗啉）乙磺酸-水合物，0.5 mol/ L NaCl, pH6. 0。3. 根据权利要求1所述的一种桔青霉毒素-蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成 法，其特征在于，偶联试剂为0.4 mg 1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺和0.6 mg N-轻基琥拍酰亚胺。4. 根据权利要求1所述的一种桔青霉毒素-蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成 法，其特征在于，步骤（3)所用蛋白载体选用牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、多聚 赖氨酸。5. 根据权利要求1所述的一种桔青霉毒素-蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成 法，其特征在于，偶联本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种桔青霉毒素‑蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）桔青霉毒素的活化预处理：将1 mg桔青霉毒素溶解于1 mL的活化缓冲液中，加入偶联试剂，摇匀后，室温避光进行偶联反应15min；（2）过量1‑乙基‑3‑（3‑二甲基氨基丙基）‑碳二亚胺的处理：向活化缓冲液中加入1.4 μL β—巯基乙醇，中和剩余的过量1‑乙基‑3‑（3‑二甲基氨基丙基）‑碳二亚胺；（3）蛋白载体的预处理：按照桔青霉毒素与蛋白载体初始摩尔比为10:1—50:1称取蛋白载体，溶解于1 mL偶联缓冲液中；（4）桔青霉毒素与蛋白载体偶联反应：调整活化缓冲液的pH至7.0以上，之后与偶联缓冲液混合，摇匀后，室温避光反应2h；（5）透析纯化：待反应结束后将反应液取出，以0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液为透析液，4 ℃透析48 h，每间隔12 h更换1次透析液，之后收集透析袋内溶液，进行紫外全波长扫描，计算偶联比，并将偶联产物冷冻干燥后‑20 ℃保存，得到桔青霉毒素—蛋白载体人工偶联抗原。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杜爱芳，程海卫，杨怡，陈学秋，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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