一种无菌松材线虫的制备方法技术

一种无菌松材线虫的制备方法是涉及无菌松材线虫的制备方法的改进。本发明专利技术提供一种灵敏快速的无菌松材线虫的制备方法。本发明专利技术包括以下步骤：将葡萄孢接种于PDA培养基上，25℃恒温培养箱中培养7天，待气生菌丝基本长满培养皿时接种松材线虫，每皿接种约200头线虫；将接种后的培养皿置25℃恒温培养箱中培养10-14天，待菌丝基本被线虫消耗完后，置于4℃储存备用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是涉及无菌松材线虫的制备方法的改进。
技术介绍
松材线虫病是松材线虫引起的松树的一种毁灭性病害，又称松树萎蔫病。松材线虫病具有导致树木死亡速度快、传播蔓延迅速、防治难度大等特点，松树一旦感染松材线虫，最快的40天左右即可枯死，幼苗感病后20多天即可枯死，3-5年便可造成大面积毁林。我国于1982年在南京中山陵首次发现松材线虫病，此后，该病在我国境内迅速扩散蔓延，危害日趋严重，现已在江苏、浙江、安徽、福建、江西、山东、河南、湖北、湖南、广东、广西、重庆、四川、贵州、陕西、香港及台湾等地区发生，发生面积达8.7万公顷，累计致死松树3,500多万株,因松材线虫病造成的直接经济损失已达25亿元，间接损失达250亿，使我国的松木资源、自然景观和生态环境遭受严重影响。
技术实现思路
本专利技术就是针对上述问题，提供一种灵敏快速的无菌松材线虫的制备方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案，本专利技术包括以下步骤。1）将葡萄孢接种于PDA培养基上，25℃恒温培养箱中培养7天，待气生菌丝基本长满培养皿时接种松材线虫，每皿接种约200头线虫；将接种后的培养皿置25℃恒温培养箱中培养10-14天，待菌丝基本被线虫消耗完后，置于4℃储存备用。2）松材线虫的分离采用贝尔曼漏斗分离法；其装置是将直径10-15cm的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约10cm的橡皮管，在橡皮管末端接一个1.5ml离心管，橡皮管上装一个弹簧夹；在漏斗内放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将面巾纸或滤纸裁剪好后放置到漏斗状网筛上，用蒸馏水浸湿滤纸，然后将待分离的培养基材料切碎放置到滤纸上；加水淹没待分离培养基材料，静止分离24h；由于趋水性和自身的重量，线虫就离开培养基材料，沉降到漏斗底部的离心管中；关闭弹簧夹，取下离心管，将管中收集到的线虫转移至另一离心管中备用。作为一种优选方案，本专利技术还包括以下步骤。将消毒松材线虫虫卵培养后获得的松材线虫，在无菌条件下用无菌水从灰葡萄孢斜面上收集下来，在无菌条件下研磨成线虫匀浆，取一部分匀浆均匀涂在NA平板上，放置到28℃恒温培养箱中培养三天，以检测虫卵消毒效果。作为另一种优选方案，本专利技术还包括以下步骤。将消毒后松材线虫匀浆用做PCR模板，未做消毒处理的线虫匀浆作为对照，同时以无菌水和大肠杆菌菌液分别作为阴性对照和阳性对照，以细菌通用引物进行PCR扩增，检测松材线虫消毒效果。本专利技术有益效果：本专利技术采用PCR方法检测消毒效果可弥补传统培养方法的缺点，结合对线虫和虫卵进行多步消毒的方法，建立了获得无菌线虫的技术。与传统培养检测的方法相比，PCR方法检测细菌污染更灵敏更快速，可检测到1克样品中存在的0.4CFU（colonyformingunits）的污染。 具体实施方式本专利技术采用如下技术方案，本专利技术包括以下步骤。1）将葡萄孢接种于PDA培养基上，25℃恒温培养箱中培养7天，待气生菌丝基本长满培养皿时接种松材线虫，每皿接种约200头线虫；将接种后的培养皿置25℃恒温培养箱中培养10-14天，待菌丝基本被线虫消耗完后，置于4℃储存备用。2）松材线虫的分离采用贝尔曼漏斗分离法；其装置是将直径10-15cm的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约10cm的橡皮管，在橡皮管末端接一个1.5ml离心管，橡皮管上装一个弹簧夹；在漏斗内放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将面巾纸或滤纸裁剪好后放置到漏斗状网筛上，用蒸馏水浸湿滤纸，然后将待分离的培养基材料切碎放置到滤纸上；加水淹没待分离培养基材料，静止分离24h；由于趋水性和自身的重量，线虫就离开培养基材料，沉降到漏斗底部的离心管中；关闭弹簧夹，取下离心管，将管中收集到的线虫转移至另一离心管中备用。本专利技术还包括以下步骤。将消毒松材线虫虫卵培养后获得的松材线虫，在无菌条件下用无菌水从灰葡萄孢斜面上收集下来，在无菌条件下研磨成线虫匀浆，取一部分匀浆均匀涂在NA平板上，放置到28℃恒温培养箱中培养三天，以检测虫卵消毒效果。本专利技术还包括以下步骤。将消毒后松材线虫匀浆用做PCR模板，未做消毒处理的线虫匀浆作为对照，同时以无菌水和大肠杆菌菌液分别作为阴性对照和阳性对照，以细菌通用引物进行PCR扩增，检测松材线虫消毒效果。以上内容是结合具体的优选实施方式对本专利技术作的进一步详细说明，不能认定本专利技术的具体实施只局限于这些说明，对于本专利技术所属
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本专利技术所提交的权利要求书确定的保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无菌松材线虫的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）将葡萄孢接种于PDA培养基上，25℃恒温培养箱中培养7天，待气生菌丝基本长满培养皿时接种松材线虫，每皿接种约200头线虫；将接种后的培养皿置25℃恒温培养箱中培养10‑14天，待菌丝基本被线虫消耗完后，置于4℃储存备用；2）松材线虫的分离采用贝尔曼漏斗分离法；其装置是将直径10‑15cm的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约10cm的橡皮管，在橡皮管末端接一个1.5ml离心管，橡皮管上装一个弹簧夹；在漏斗内放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将面巾纸或滤纸裁剪好后放置到漏斗状网筛上，用蒸馏水浸湿滤纸，然后将待分离的培养基材料切碎放置到滤纸上；加水淹没待分离培养基材料，静止分离24h；由于趋水性和自身的重量，线虫就离开培养基材料，沉降到漏斗底部的离心管中；关闭弹簧夹，取下离心管，将管中收集到的线虫转移至另一离心管中备用。

【技术特征摘要】
1.一种无菌松材线虫的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将葡萄孢接种于PDA培养基上，25℃恒温培养箱中培养7天，待气生菌丝基本长满培养皿时接种松材线虫，每皿接种约200头线虫；将接种后的培养皿置25℃恒温培养箱中培养10-14天，待菌丝基本被线虫消耗完后，置于4℃储存备用；
2）松材线虫的分离采用贝尔曼漏斗分离法；其装置是将直径10-15cm的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约10cm的橡皮管，在橡皮管末端接一个1.5ml离心管，橡皮管上装一个弹簧夹；在漏斗内放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将面巾纸或滤纸裁剪好后放置到漏斗状网筛上，用蒸馏水浸湿滤纸，然后将待分离的培养基材料切碎放置到滤纸上；加水淹没待分离培养基材料，静止分离24h；由于趋水性和自身的重量...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜丹宁，李杰，齐晓倩，
申请(专利权)人：姜丹宁，
类型：发明
国别省市：辽宁;21