一种布鲁氏杆菌新型疫苗及其生产方法技术

本发明专利技术公开了一种布鲁氏杆菌新型疫苗及其制备方法。该方法包括一级菌种制备、二级菌种制备和菌液培养；其中，在50%葡萄糖补料中，添加0.01ug/L-100ug/L的白细胞介素2，和（或）0.01ug/L-100ug/L的维生素B1，和（或）0.01%-10%的微量元素。本发明专利技术方法使培养菌数得到大幅度提高，培养液中菌数可达1500-2000亿/ml，在应用时无需对该菌液进行浓缩处理，具有产量高、生产成本低等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种布鲁氏杆菌新型疫苗及其生产方法，属于基因工程生物制药领域。。
技术介绍
布鲁氏菌病(Brucellosis)也称布氏杆菌，是一种由布鲁氏菌(Brucella)引起的世界范围流行的人畜共患病，严重威胁人类和多种动物的生命健康，造成巨大的经济损失。临床特点是缓慢起病，长期发热、多汗、虚弱、全身痛和关节痛，急性期症状多在3 - 6月内消退。布氏杆菌共分为牛、羊、猪、沙林鼠、绵羊和犬布氏杆菌六种。在中国发现的主要为前三种。布氏杆菌为细小的短杆状或球杆状，不产生芽胞，革兰氏染色阴性的杆菌。布氏杆菌对热敏感，70℃10分钟即可死亡；光直射1小时死亡；在腐败病料中迅速失去活力；一般常用消毒药都能很快将其杀死。潜伏期短者两周，长者可达半年。母牛流产是本病的主要症状，流产多发生于怀孕5-7个月，产出死胎或软弱胎儿。母牛流产后常伴有胎衣不下或子宫内膜炎，阴道内继续排出红褐色恶臭液体，可持续2-3周，患病公牛常发生睾丸炎或附睾炎。人也可感染该病，表现为长期发热、多汗、关节痛、神经痛及肝、脾肿大等症状。该病严重损害人和动物的健康，OIE将其列为B类动物疫病，中国将其列为二类动物疫病。布氏杆菌病对畜牧业和人类健康均构成严重威胁，疫苗免疫是预防和控制布氏杆菌病的主要措施。由于布氏杆菌胞内寄生的特点，只有利福平等少数的几种抗生素对其治疗有效，但这些抗生素的副作用很大，不能长期服用，因此一旦发病并转为慢性则无法根治，并能反复发作。因此，接种疫苗是预防布氏杆菌病的最有效的手段。对布鲁氏菌疫苗的研究已经很多年。其研发策略经历了逐渐改进和完善的过程，根据不同时期研究策略侧重点不同，可以将其大致分为三个阶段。第一阶段：传统疫苗(活苗，死苗)：在布鲁氏菌防治方面发挥了重要的作用。其中牛用S19，猪用S2，羊用M5，仍然是防治布鲁氏菌病的重要疫苗。在传统疫苗中，活苗的免疫效果虽然很好，但是对接种的动物造成一定的影响，对人也会引起感染，且易发生返祖现象。死苗虽然不会出现上述现象，但其免疫效果不好，用量大，遗传稳定性差。第二阶段：20世纪70年代以来，迅速发展的重组DNA技术为疫苗的研究提供了新的手段。布鲁氏菌基因工程疫苗也开始发展。核酸疫苗、亚单位疫苗、基因缺失疫苗等成为科学家们的研究热点。基因工程疫苗克服了传统疫苗的易返祖，影响接种动物等不足，且其安全问题比较容易控制和处理，因此，基因工程疫苗将在防治布鲁氏病中做出重大的贡献。第三阶段：2000年6月26日，人类基因组测序完成标志着人类进入了后基因组时代。疫苗的研究也开始改变过去从表型分析人手的思维方式，而是从全基因水平来筛选具有保护性免疫反应的候选抗原。这种以基因组为基础的疫苗发展策略，称为反疫苗学。2002年以来，羊种、牛种、猪种布鲁氏菌基因组测序相继完成，为反疫苗学研发打下了基础。布鲁氏菌蛋白质组学的研究将成为当今疫苗研究的一个热点。现有的畜用减毒活疫苗有S19、S2、M5和RB5l等，死疫苗有牛种布鲁氏菌45／20，羊种布鲁氏菌H38等，人用活疫苗主要有19-B和104M等。但无论是何种疫苗，动物接种疫苗后， 由于人工免疫和自然感染动物所表现的临床症状相似，很难鉴别是人工免疫还是自然感染，给动物的检疫、运输、宰杀带来了困难。现有的布氏杆菌活疫苗的生产规程方法如下:一级菌种制备：冻干菌种开封后，用蛋白胨水溶解，划线移植于胰蛋白眎琼脂平板或其他适宜培养基上，在36~37℃培养2~3日。选取合格菌落10个以上，移植于胰蛋白胨琼脂斜面培养基，36~37℃培养48~72小时，作为一级种子。在2~8℃保存，使用期应不超过1个月。二级菌种制备：取一级菌种接种于胰蛋白眎琼脂扁平或其他适宜培养基，置36~37℃培养48~72小时，肉眼检查纯净后，每个扁平加蛋白胨水适量，将菌苔洗下，接种于1万~ 2万ml的适宜液体培养基，置36~37℃培养48~72小时，进行纯粹检验后置2~8℃保存，使用期应不超过30天。菌液培养：按培养基量加入适量的消泡剂，灭菌后按培养基量的1% ~ 2%接种二级菌种，在36~37℃逐渐增大通气量，培养36小时，培养过程中可根据需要加入50%的葡萄糖溶液，每次加入量为培养基总量的1%~2 %。按现有的规程进行布氏杆菌活疫苗(A19株)生产所培养得到菌液的活菌数为800~ 1000亿/ml，需要对该菌液进行浓缩处理，存在产量低、生产成本高等问题，有待改进。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有的布氏杆菌活疫苗的生产方法中所存在的产量低、生产成本高等问题，提供一种新的布氏杆菌活疫苗的生产方法，该生产方法所培养得到菌液的菌数可达1500-2000亿/ml，具有存在产量高、生产成本低等优点。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:一种布氏杆菌病活疫苗的制备方法，包括一级菌种制备、二级菌种制备和菌液培养；其中在菌液培养补料阶段，在50%葡萄糖中添加0.01ug/L~100 ug/L的白细胞介素2（IL2），能够有效的提高培养液的细菌数量。本专利技术进一步发现，其中在菌液培养阶段，在50%葡萄糖中添加0.01ug/L~100 ug/L的维生素B1，能够有效的提高培养液的细菌数量。本专利技术进一步发现，其中在菌液培养阶段，在50%葡萄糖中添加0.01%~10% 的微量元素，能够有效的提高培养液的细菌数量。每1000ml微量元素含硫酸锌（ZnSO4）2g、硫酸锰（MnSO4）10g、氯化铜（CuCl2）1g、硫酸钴（CoSO4 · 7H2O）2g、硼酸（H3BO4）0.5g、三氯化铁（FeCl3 · 6H2O）27g、三氯化铝（AlCl3 · 6H2O）10g、盐酸50ml，加去离子水至1000ml。总之，本专利技术方法在菌液培养阶段，尤其是在补料阶段，添加适量的白细胞介素2，和（或）适量维生素B1，和（或）适量微量元素，能使培养菌数得到大幅度提高，培养液中菌数可达1500-2000亿/ml，在应用时无需对该菌液进行浓缩处理，具有产量高、生产成本低等优点。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1一级菌种制备: 布鲁氏杆菌新型疫苗冻干菌，开封后，用蛋白胨水溶解，划线移植于胰蛋白胨琼脂平板或其它适宜培养基上，在37℃培养3日。选取合格菌落10个以上，移植于胰蛋白胨琼脂斜面培养基，37℃培养72小时，作为一级种子，在2~8℃保存；二级菌种制备：取一级菌种接种于胰蛋白胨琼脂扁平或其它适宜培养基，置37℃培养72小时，肉眼检查纯净后，每个扁平加蛋白胨水适量，将菌苔洗下，接种于1万ml的马丁肉汤液体培养基中，置37℃培养72小时，进行纯粹检验后得到二级菌种，置2-8℃保存；每1000m1马丁肉汤培养基的成分为：牛肉汤500m1，猪胃消本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种布鲁氏杆菌疫苗的制备方法，包括一级菌种制备、二级菌种制备和菌液培养；其特征在于：在50%葡萄糖补料中，添加包括选自0.01ug/L~100 ug /L的白细胞介素2、0.01ug/L~100 ug/L的维生素B1或0.01%~10% 的微量元素中的一种或多种。

【技术特征摘要】
1.一种布鲁氏杆菌疫苗的制备方法，包括一级菌种制备、二级菌种制备和菌液培养；其特征在于：在50%葡萄糖补料中，添加包括选自0.01ug/L~100 ug /L的白细胞介素2、0.01ug/L~100 ug/L的维生素B1或0.01%~10% 的微量元素中的一种或多种。
2.权利要求1所述的制备方法，其特征是所述白细胞介素2选自人白细胞介素2，牛白细胞介素2、羊白细胞介素2、猪白细胞介素2、犬白细胞介素2或鸡白细胞介素2。
3.权利要求1所述的制备方法，每1000ml所述微量元素含硫酸锌...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈黄实，李金岭，何萍，陈嫚，
申请(专利权)人：北京中科拜克生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11