本发明专利技术涉及一种白细胞介素-31多克隆或单克隆抗体的制备方法及应用，白细胞介素－31是近年发现的具有4个螺旋结构的多肽链，为Th2型细胞因子，具有调节细胞增殖分化、促进造血、参与炎症反应等多种生物学功能，是一种重要的炎症因子，在炎症反应和过敏性疾病中发挥重要的作用。白细胞介素-31多克隆抗体或单克隆抗体的制备方法分为以下几个步骤：大肠杆菌E.coli.BL21的培养及rhIL-31的诱导表达；免疫原制备；免疫原注射试验动物；提取抗体；IL-31多克隆或单克隆抗体特异性鉴定。IL-31多克隆或单克隆抗体的应用包括：ELISA检测方法及试剂和抗体外用治疗及皮肤保健应用。
【技术实现步骤摘要】
白细胞介素-31多克隆或单克隆抗体的制备方法及应用
本专利技术涉及医药生物
，特别是涉及白细胞介素-31多克隆或单克隆抗体的制备方法及应用。
技术介绍
白细胞介素31 (interleuking-31, IL-31)是近年发现的具有4个螺旋结构的多肽链，为Th2型细胞因子，具有调节细胞增殖分化、促进造血、参与炎症反应等多种生物学功能，是一种重要的炎症因子，在炎症反应和过敏性疾病中发挥重要的作用。Dillon等在“Nature Immunology”杂志上报道通过建立IL-31转基因小鼠、IL-31RA缺陷型小鼠、淋巴细胞缺陷型小鼠，生物学活性研究结果提示，IL-31通过刺激人正常上皮角质细胞(NHEKs)释放趋化因子如胸腺活化调节的趋化因子(TARC)和巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)，导致淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞向表皮聚集。同时发现IL-31以一种非IgE依赖的方式诱发小鼠出现皮肤搔痒和脱毛，其行为和血清学表现类似于人类特应性皮炎(atopicdermatitis，AD)。AD是一种难治性、慢性、炎症性皮肤病，好发于过敏性体质的婴幼儿及青少年，由于反复发作且患者常因为难耐瘙痒而抓得身上伤痕累累，严重影响了患者的生活。目前，在美国、加拿大、德国、日本等国普遍使用非类固醇局部免疫调节剂如他克莫司软膏作为特应性皮炎的治疗药物，这些治疗措施都只能使特应性皮炎的症状有所缓解，但达不到治疗病因的目的。 Sonkoly E等通过检测正常个体和慢性皮肤炎症患者皮肤标本中IL-31的表达和IL-31异二聚体受体的分布，发现IL-31在搔痒性特应性皮炎患者的表达明显高于非搔痒性皮炎患者。研究提示，IL-31与特应性皮炎等搔痒性皮肤病的发生有一定的关系。鉴于IL-31与搔痒性皮肤疾病可能存在的相关性，进一步深入研究其生物学功能，将有望成为研究特应性疾病的发病机制及其治疗方案的新的切入点。本研究针对rhIL-31进行相应的动物试验，观察小鼠皮内注射rhIL-31后的反应，从生理学、组织病理学、血清学等多个方面进行rhIL-31的生物学活性研究，为IL-31在搔痒性皮肤炎症发病中的作用的研究提供证据，为以IL-31切入点探索搔痒性皮肤病的治疗方案奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种白细胞介素-31多克隆抗体或单克隆抗体的制备方法，并将所得抗体制剂应用于相关人群的诊断、治疗和保健。 白细胞介素-31多克隆抗体的制备方法，该制备方法的具体步骤如下: (I)、大肠杆菌E.col1.BL21的培养及rhIL-31的诱导表达 ①.挑取含pET-32a/rhIL-31质粒的大肠杆菌E.col1.BL21单菌落各一个，接种于含100 μ g/ml氨苄青霉素的5ml LB培养基；37°C 200r/min培养18?24hrs;②.次日分别吸取重组菌Iml加入50ml含有相应抗生素的LB液体培养基的锥形瓶中，37°C 200r/min继续培养至0D600约为0.6左右，分采集Iml菌液于EP管中，剩余菌液加入IPTG至终浓度为lmmol/L，诱导培养18?24h，收集菌液Iml于EP管，12000r/min离心30s后弃上清，沉淀菌体中加入100 μ I IX蛋白上样缓冲液，混匀后煮沸5min，4°C保存待用；③.经N1-NTA琼脂糖凝胶FF柱对表达蛋白纯化，SDS-PAGE分析蛋白表达情况，采用B1-Rad图像分析系统测定rhIL-31蛋白； (2)、rhIL-31免疫原制备①.称取羊脂Sg，量取石腊油32ml，置高压灭菌器灭菌后用无菌研钵研磨均匀，置4°C冰箱过夜，次日仍均匀粘稠无分层，即成为福氏不完全佐剂；②.将福氏不完全佐剂放人无菌研钵、按一个方向边研磨边加入卡介苗，以1ml不完全佐剂计，应加卡介苗3?10mg，研磨毕置4°C过夜，如不分层即可使用，此为福氏完全佐剂；③.将福氏完全佐剂置于研钵内，边研磨边滴加等量rhIL-31，3mg/ml，直至形成白色油包水乳剂，滴加于水中完全不散开即为合格，置于4°C保存备用；(3)、IL-31多克隆抗体制备①.选用2?2.5kg健康家兔，于颈后、两后肢大腿外侧共三个部位皮下各注射IL-31佐剂抗原0.5ml，每只注射IL-31量为Img ；②.7d后再次同样于颈后、两后肢大腿外侧共三个部位皮下各注射IL-31佐剂抗原0.5ml，每只注射IL-31量为Img ;21d后、28天后分别于颈后、两后肢大腿外侧共三个部位皮下注射无佐剂IL-31抗原0.5ml ；③.末次注射后第7d试血，双向琼脂扩散试验效价达1: 16?1: 32，ELISA法试验效价达1: 10000?1: 15000放血收集血清，此即兔抗IL-31免疫血清；④.采用硫酸铵盐析法粗提取兔IL-31抗体IgG:免疫血清10ml加生理盐水10 ml混合，加入饱和硫酸铵2Xml，缓慢滴加边搅拌边，使硫酸铵饱和度达50%, 4°C,静置3h以上，3000rpm离心20min,弃上清,沉淀物用生理盐水稀释至Xml,边搅拌边滴加饱和琉酸铵1/2X ml，使饱和度为33%，41:静置311以上，3000rpm离心20min，弃上清；重复沉淀物用生理盐水稀释至Xml，边搅拌边滴加饱和琉酸铵1/2 X ml，使饱和度为33%，4°C静置3h以上，3OOOrpm离心20min，弃上清2遍。最后一次加少许生理盐水溶解沉淀物装入透析袋，置4°C用PBS透析除盐，更换透析液数次直至:奈氏试剂测定无NH4+,，I % BaClJlJ定无SO广，最后测定蛋白含量，置于4°C保存备用。 白细胞介素-31单克隆抗体的制备方法，其具体步骤如下:(1).人IL-31及免疫原制备分析IL-31氨基酸序列，选择合适的抗原表位序列I和序列2，序列1:aa24-39，SHTLPVRLLRPSDDVQC ;序列2:aal55_164，CLTSGAQQATT ;合成抗原表位序列，合成的抗原表位序列与牛血清白蛋白偶联成免疫原BSA-1L-31多肽；(2).单克隆抗体制备①动物免疫:取浓度为0.5mg/ml的BSA-1L-31多肽与等体积的完全弗氏佐剂混合，免疫BALB/c小鼠，0.5ml/只，两周后采用免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂完全混合，加强免疫，尾静脉采血用间接ELISA法检测抗体效价，选择效价较高的小鼠2周后腹腔冲击免疫； ②细胞融合与杂交瘤细胞的筛选:免疫小鼠脾细胞和SP2/0细胞按PEG方法进行融合，置5%C02，37°C培养；于融合后第8天用间接ELISA法对细胞培养上清进行抗体检测，选择抗体效价高的杂交瘤细胞通过有限稀释法进行亚克隆，直至亚克隆后凡是有细胞生长的孔的抗体检测均为阳性，且OD值(A值)相近，将稳定分泌抗体的杂交瘤细胞转至24孔板内扩大培养；③腹水抗体的生产与纯化:将杂交瘤细胞腹腔注射BALB/c小鼠，2X16个/只，7至10天后小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水，Protein A亲和层析法对单克隆抗体进行初步纯化，ELISA法鉴定抗体的效价；④单克隆抗体效价测定:取已包被抗原BSA-1L-31-多肽的酶标板，加入倍比稀释的抗体，稀释比例依次为1:200、1:1000、1:5000本文档来自技高网...
【技术保护点】
白细胞介素‑31多克隆抗体的制备方法，其特征在于：该制备方法的具体步骤如下：(1)、大肠杆菌E.coli.BL21的培养及rhIL‑31的诱导表达①.挑取含pET‑32a/rhIL‑31质粒的大肠杆菌E.coli.BL21单菌落各一个，接种于含100μg/ml 氨苄青霉素的5ml LB 培养基； 37℃ 200r/min培养18～24hrs;②.次日分别吸取重组菌1ml加入50ml含有相应抗生素的LB液体培养基的锥形瓶中，37℃ 200r/min继续培养至OD600约为0.6左右，分采集1ml菌液于EP管中，剩余菌液加入IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导培养18～24h，收集菌液1ml于EP管，12000r/min离心30s后弃上清，沉淀菌体中加入100μl 1×蛋白上样缓冲液，混匀后煮沸5min，4℃保存待用;③.经Ni‑NTA琼脂糖凝胶FF柱对表达蛋白纯化，SDS‑PAGE分析蛋白表达情况，采用Bio‑Rad图像分析系统测定rhIL‑31蛋白;(2)、rhIL‑31免疫原制备称取羊脂8g，量取石腊油32ml，置高压灭菌器灭菌后用无菌研钵研磨均匀，置4℃冰箱过夜，次日仍均匀粘稠无分层，即成为福氏不完全佐剂;②.将福氏不完全佐剂放人无菌研钵、按一个方向边研磨边加入卡介苗,以10ml不完全佐剂计，应加卡介苗3～10mg，研磨毕置4℃过夜，如不分层即可使用，此为福氏完全佐剂;③.将福氏完全佐剂置于研钵内，边研磨边滴加等量rhIL‑31,3mg/ml，直至形成白色油包水乳剂，滴加于水中完全不散开即为合格，置于4℃保存备用；(3)、IL‑31多克隆抗体制备选用2～2.5kg健康家兔，于颈后、两后肢大腿外侧共三个部位皮下各注射IL‑31佐剂抗原0.5ml，每只注射IL‑31量为1mg；②.7d后再次同样于颈后、两后肢大腿外侧共三个部位皮下各注射IL‑31佐剂抗原0.5ml，每只注射IL‑31量为1mg；21d后、28天后分别于颈后、两后肢大腿外侧共三个部位皮下注射无佐剂IL‑31抗原0.5ml；③.末次注射后第7d试血，双向琼脂扩散试验效价达1∶16～1∶32，ELISA法试验效价达1∶10000～1∶15000放血收集血清，此即兔抗IL‑31免疫血清；④.采用硫酸铵盐析法粗提取兔IL‑31抗体IgG：免疫血清10 ml加生理盐水10 ml混合，加入饱和硫酸铵2Xml，缓慢滴加边搅拌边，使硫酸铵饱和度达50％， 4℃，静置3h以上，3000rpm离心20min，弃上清，沉淀物用生理盐水稀释至Xml，边搅拌边滴加饱和琉酸铵1/2 X ml，使饱和度为33％，4℃静置3h以上，3000rpm离心20min，弃上清；重复沉淀物用生理盐水稀释至Xml，边搅拌边滴加饱和琉酸铵1/2 X ml，使饱和度为33％，4℃静置3h以上，3 000rpm离心20min，弃上清2遍；最后一次加少许生理盐水溶解沉淀物装入透析袋，置4℃用PBS透析除盐，更换透析液数次直至：奈氏试剂测定无NH4+，，1％BaCl2测定无SO42‑，最后测定蛋白含量，置于4℃保存备用。...
【技术特征摘要】
1.白细胞介素-31多克隆抗体的制备方法，其特征在于:该制备方法的具体步骤如下: (1)、大肠杆菌E.col1.BL21的培养及rhIL-31的诱导表达 ①.挑取含pET-32a/rhIL-31质粒的大肠杆菌E.col1.BL21单菌落各一个，接种于含100 μ g/ml氨苄青霉素的5ml LB培养基；37°C 200r/min培养18?24hrs; ②.次日分别吸取重组菌1ml加入50ml含有相应抗生素的LB液体培养基的锥形瓶中，37°C 200r/min继续培养至0D600约为0.6左右，分采集1ml菌液于EP管中，剩余菌液加入IPTG至终浓度为lmmol/L，诱导培养18?24h，收集菌液1ml于EP管，12000r/min离心30s后弃上清，沉淀菌体中加入100 μ 1 IX蛋白上样缓冲液，混匀后煮沸5min，4°C保存待用； ③.经N1-NTA琼脂糖凝胶FF柱对表达蛋白纯化，SDS-PAGE分析蛋白表达情况，采用B1-Rad图像分析系统测定rhIL-31蛋白； (2)、rhIL-31免疫原制备 称取羊脂8g，量取石腊油32ml，置高压灭菌器灭菌后用无菌研钵研磨均匀，置4°C冰箱过夜，次日仍均匀粘稠无分层，即成为福氏不完全佐剂； ②.将福氏不完全佐剂放人无菌研钵、按一个方向边研磨边加入卡介苗，以10ml不完全佐剂计，应加卡介苗3?10mg，研磨毕置4°C过夜，如不分层即可使用，此为福氏完全佐剂； ③.将福氏完全佐剂置于研钵内，边研磨边滴加等量rhIL-31，3mg/ml，直至形成白色油包水乳剂，滴加于水中完全不散开即为合格，置于4°C保存备用； (3)、IL-31多克隆抗体制备 选用2?2.5kg健康家兔，于颈后、两后肢大腿外侧共三个部位皮下各注射IL-31佐剂抗原0.5ml，每只注射IL-31量为lmg ； ②.7d后再次同样于颈后、两后肢大腿外侧共三个部位皮下各注射IL-31佐剂抗原0.5ml，每只注射IL-31量为lmg ;21d后、28天后分别于颈后、两后肢大腿外侧共三个部位皮下注射无佐剂IL-31抗原0.5ml ； ③.末次注射后第7d试血，双向琼脂扩散试验效价达1: 16?1: 32，ELISA法试验效价达1: 10000?1: 15000放血收集血清，此即兔抗IL-31免疫血清； ④.采用硫酸铵盐析法粗提取兔IL-31抗体IgG:免疫血清10ml加生理盐水10 ml混合，加入饱和硫酸铵2Xml，缓慢滴加边搅拌边，使硫酸铵饱和度达50%, 4°C，静置3h以上，3000rpm离心20min,弃上清，沉淀物用生理盐水稀释至Xml,边搅拌边滴加饱和琉酸铵1/2X ml，使饱和度为33%，41:静置311以上，3000rpm离心20min，弃上清；重复沉淀物用生理盐水稀释至Xml，边搅拌边滴加饱和琉酸铵1/2 X ml，使饱和度为33%，4°C静置3h以上，3OOOrpm离心20min,弃上清2遍； 最后一次加少许生理盐水溶解沉淀物装入透析袋，置4°C用PBS透析除盐，更换透...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄俊琼，孙万邦，魏培，郑静，曹雪梅，董革辉，
申请(专利权)人：遵义医学院附属医院，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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