耐热碱性木聚糖酶基因xylGT优化序列及其高效表达方法技术

本发明专利技术公开了一种耐热碱性木聚糖酶基因xylGT优化序列及其高效表达方法，其序列如SEQ ID NO.1，在1140个碱基中，具有270个点突变，本发明专利技术在最优条件下，木聚糖酶活达到82.24U/ml，比优化前菌株发酵产量提高了1.25倍。并在发酵罐上对产酶条件进行了试验，最大生产率为4.779U/(mL·h)，酶活为454U/mL，比改良前酶活提高了1.36倍，同时产酶时间延长了14h。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，特别涉及耐热碱性木聚糖酶基因xylGT优化序列及其高效表达方法。
技术介绍
现今木聚糖酶的应用领域不断扩大，已成功应用于食品、医药、造纸等工业中。在造纸工业中有制浆这一工艺，在这步工艺中需要去除木质素达到漂白的目地，传统去除的方法就是加强酸强碱，这对环境产生很大的污染。而用木聚糖酶进行辅助漂白，不仅可以提高纸浆的白度，还可减少后续化学漂白剂的添加量，这样明显的降低漂白废水中有机污染物氯代的产生；本研究专利技术涉及的耐热碱性木聚糖酶在纸浆造纸行业有很好的运用前景。在食品行业中，木聚糖酶不仅可以作为面包改良剂，可改善面团的稳定性和对过度发酵的耐受性，聚糖酶还能够降解果汁和啤酒中的多糖，因而有利于饮料的澄清，木聚糖酶可降解多糖来生产低聚木糖，低聚木糖是一种具有低热量和低糖度易吸收特性的重要的食品添加剂。木聚糖酶在其它方面也具有很大的潜在价值，例如在果蔬制品的生产中，木聚糖酶不仅能提高果蔬的汁浸出率及压榨能力，也可以降低了生产成本；在饲料中添加木聚糖酶可消除或降低低阿拉伯木聚糖抗营养作用；在制药工业中，木聚糖酶可用来制作缓释药物的原料。鉴于木聚糖酶具有重要的实际应用价值，人们希望能够将木聚糖酶投入实际应用，现阶段必须克服的问题是怎样降低它的生产成本提高它的产量。为解决这个问题，人们尝试通过诱变野生菌选育高产菌、利用基因工程手段构建重组工程菌、培养条件的优化等等一些列手段来提高木聚糖酶的产量。在高产菌选育方面，人们一般通过过紫外(UV)，亚硝基胍(NTG)来诱变处理野生菌以期得到产木聚糖酶最高的最佳突变菌株，该方法经济且快速。为了寻找适合工业应用的木聚糖酶，人们从嗜极性生物中寻找能产木聚糖酶的微生物，目前在嗜碱性微生物中发现了一些微生物可产生木聚糖酶，但大多数是细菌；在嗜热性微生物中发现细菌，真菌和放线菌中都能产生木聚糖酶，这些酶在极端温度和pH下仍然有很高的活性，因此更具有广阔的应用前景；在基因克隆方面，目前已发现的木聚糖酶基因有xynA,xynB,xynC,xynZ等，最初是将它们克隆转到宿主大肠杆菌中，发现这些基因在大肠杆菌中虽然能够表达但表达的蛋白不能分泌到胞外，必须破碎细胞才能检测到蛋白。人们将嗜热细菌的木聚糖酶基因克隆到毕氏酵母分泌表达载体中，转化入宿主毕赤酵母中，将有活性的木聚糖酶分泌到胞外来，便于后期分离纯化。在选择巴氏毕赤酵母为外源基因表达系统时，必须要考虑的问题就是该用什么样的方法实现外源目的蛋白在该系统的高效表达，从一些报道可总结出大致从以下方面来进行改进：1)首先从基因水平对其改造。外源基因必须重组到巴氏毕赤酵母的染色体上才能在甲醇的诱导下表达出来，因此它自身的结构性质在很大程度上影响其在系统中的高效表达。一般来说外源基因AT与GC的含量都要适宜，AT太高会直接导致提前终止基因的翻译表达，有报道称AT含量在30％-55％之间最有利于外源基因在毕赤酵母中的高效表达；如果外源基因的GC含量过高则容易造成翻译能障过高，翻译过程很难进行下去，不利于外源基因在毕赤酵母中的高效表达。另外在构建外源基因时要充分考虑到巴氏毕赤酵母密码子的偏爱。所谓密码子偏爱性就是某物种高表达的基因会使用特定的同义密码子，这些密码子则是该物种的优越密码子。研究发现毕赤酵母的优越密码子大约有25个，因此为了增加外源蛋白的表达量，在构建外源基因的时候要尽量用到这25个密码子且尽量避免用稀有密码子。2)适当增加目的基因拷贝数。研究表明适当增加拷贝数可以提高外源基因表达量。但是,过多的外源基因的拷贝数也可能导致重组DNA不稳定造成外源目的蛋白表达量的降低。外源基因拷贝数与对G418或zeocin的抗性成正比，因此可利用不同浓度的G418或zeocin来鉴别拷贝数的多少。3)外源基因整合到酵母染色体上的方式。在将重组载体整合到酵母染色体之前，一般会选着不同的酶切位点把重组载体线性化，选择不同的酶将有不同的整合方式，挑选最有利于外源基因表达的整合方式。4)优化培养条件。一种微生物能否正常代谢生长产酶，需要合适的外界培养条件。不同的培养条件对于巴氏毕赤酵母表达系统高效表达外源蛋白有着举足轻重的影响例如温度、pH、溶氧等，这些培养条件一方面作用于菌体的生长状况，另一方面也影响着外源蛋白的活性，最有利于菌体生长的条件并不意味这是最有利于产酶的条件，在探究最优条件时要综合考虑这两方面。例如毕赤酵母的最佳生长温度是30℃，但有研究表明15℃的诱导温度可以显著提高外源蛋白的表达；毕赤酵母的最佳生长pH是3-7，假如培养基的pH不在这个范围，菌体的生长量没多大变化但是对产生的蛋白质有很大影响。另外，培养基中的碳氮比以及诱导剂的添加量也对蛋白的表达起到至关重要的作用，在优化培养条件时要充分考虑这两点。
技术实现思路
为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供耐热碱性木聚糖酶基因xylGT优化序列及其高效表达方法，使用DNAworks软件以及mRNA的稳定性分析软件RNA Structure 4.3，将来源于Geobacillus thermoleovorans的xylGT基因(GenBank登录号：JN680872)，按照毕赤酵母的密码子偏爱性,对出发菌株的木聚糖酶基因进行优化改良，将优化后的xylGT基因序列进行优化而来。在其引物5’端添加了EcoRI限制性酶切位点，引物3’端引入了NotI限制性酶切位点,经PCR扩增，连接转化，测序验证，得到碱性木聚糖酶xylGT的优化基因序列。将优化后的木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母GS115的表达载体pPIC9K上，得到重组表达载体pPIC9K-xylGT，再将重组表达载体电转化到宿主毕赤酵母中，通过在不含组氨酸的基础培养基(MD)以及菌落PCR初步筛选出阳性克隆，结合G418抗性和含木聚糖的平板上水解圈大小筛选高拷贝菌株，并从中成功地筛选了一株高产木聚糖酶的重组菌P.pastoris GS115/xyl。在此基础上，采用单因子实验、Plackett-Burman设计、最陡爬坡实验、响应面设计相结合的方法，对重组菌株产xylanase在摇瓶水平上的发酵条件进行优化，找到最优发酵条件以期提高xylanase的表达量，降低xylanase的生产成本。在最优条件下，木聚糖酶活达到82.24U/ml，比优化前菌株发酵产量提高了1.25倍。并在发酵罐上对产本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐热碱性木聚糖酶基因xylGT核苷酸优化序列，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1，在1140个碱基中，具有270个点突变。

【技术特征摘要】
1.一种耐热碱性木聚糖酶基因xylGT核苷酸优化序列，其特征
在于，其序列如SEQ ID NO.1，在1140个碱基中，具有270个点突
变。
2.一种耐热碱性木聚糖酶基因xylGT核苷酸优化序列的高效表
达方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、根据毕赤酵母密码子偏爱将原始基因进行优化，PCR
扩增合成全长木聚糖酶基因xylGT；
步骤二、将优化的木聚糖酶基因xylGT与表达载体pPIC9K分别
进行双酶切，经连接得到重组质粒pPIC9K-xylGT；
步骤三、将经SalⅠ酶切线性化后的pPIC9K-xylGT重组质粒电
转化到毕赤酵母宿主菌GS115中，在基本培养基平板上初步筛选到
阳性菌落，通过PCR进一步鉴定筛选得到重组工程菌GS115/xyl；根
据G418抗性筛选出高拷贝的阳性转化子，再将高拷贝的阳性转化子
转移到含有0.05％木聚糖的缓冲甲醇培养基平板上,挑选产水解圈大

【专利技术属性】
技术研发人员：闫达中，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，桂林精成生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42