无染色剂蛋白定量和标准化制造技术

本发明专利技术公开了使用卤烷基化色氨酸荧光进行蛋白定量和标准化的方法。使用与色氨酸残基反应以形成荧光产物的卤代有机化合物(即卤代烷)处理来自没有共同蛋白分布的多种来源的复杂的蛋白样品(即各自含有1000或更多种不同蛋白的样品)。随后使用紫外光对样品进行辐照并对所得来自各样品中所有蛋白的荧光发射进行检测和定量以获得多个样品之间总蛋白含量的可比数值。发现如此获得的数值是比较性总蛋白含量的有效指标，尽管由于来源各异，色氨酸水平在任何单个样品的多种蛋白和样品间存在广泛差异，这将倾向于在特性和所含蛋白的相对量方面对其自身进行区分。还对蛋白样品进行标准化以校正样品稀释、样品加载和蛋白转移不一致造成的差异，方法为对各样品中总蛋白进行无染色剂检测或对各样品中的子样品进行检测。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉参考本申请要求2012年4月27日提交的标题为“Stain-free total protein quantification of complex samples from diverse sources(来自多种来源的复杂样品的无染色剂总蛋白定量)”的美国临时申请号61/639,692的优先权，其全部内容通过引用纳入本文以用于所有目的。本申请还要求2012年4月27日提交的标题为“Stain-free technology for western blot total normalization(用于western印迹总体标准化的无染色剂技术)”的美国临时申请号61/639,686的优选权，其全部内容通过引用纳入本文以用于所有目的。专利技术背景生物技术中的实验室过程通常包括单个蛋白的检测、鉴定和定量。然而，除各混合物中的单个蛋白外，某些步骤还需要对整个蛋白混合物进行定量，同时需要或不需要使单个蛋白彼此分离或区分。这类总蛋白定量是有价值的，例如在比较来自不同样品的蛋白量时，包括来自不同对象、不同生物体和不同物种，或者来自处于不同发育阶段或疾病或疾病病症的不同阶段的同一物种或对象的样品。在这些情况下，总蛋白测定可揭示基因表达的定量变化，在诊断、治疗和治疗剂的测试中具有价值。总蛋白测定也可用于检测分析系统中的样品加载和蛋白转移。例如，在将样品加载至微孔板的单个孔或电泳凝胶的单条泳道中时，需要多个孔或泳道间具有均一和恒定的加载量以确保对样品所进行的任何分离或其他步骤中能够做出适当的比较。蛋白转移在例如Western印迹中发生，这也是受关注的领域，因为总蛋白定量可显示印迹是否正确实施，或是否出现了不完全转移。使用常规染色剂(如COOMASSIETM亮蓝(巴斯夫公司(BASF Aktiengesellschaft)，德国路德维希)、Ponceau S(西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)，美国密苏里州圣路易斯)和SYPRO RUBYTM(西格玛-艾尔德里奇公司)的蛋白检测和定量是已知的。Edwards等在美国专利号US 7,569,103B2(2009年8月4日)和US 8,007,646B2(2011年8月30日)中公开了无染色剂技术，其中引发色氨酸的吲哚部分和多个卤素取代的有机化合物中任意一个(特别提到了氯仿、三氯乙醇和三氯乙酸)之间的UV光诱导的反应以生成发射波长在可见光范围内的荧光化合物。该技术因此包括使用含卤素试剂处理蛋白或其中存在蛋白的凝胶，使蛋白或凝胶暴露于UV光，并对所得单个蛋白条带的发射光进行检测和定量。色氨酸在蛋白中相对稀少，且各蛋白中色氨酸残基与总氨基酸残基的比例彼此间差异很大。基于此，对目前无染色剂技术应用的认识受到了限制。因此，已知该技术可用于比较同一蛋白的不同样品，例如，通过比较各样品中相同分子量蛋白的单个条带的强度。不同样品中不同蛋白条带之间的比较是徒劳的，因为不同蛋白很可能具有不同的色氨酸含量，因此无法预期在以相同量存在时产生相同的信号强度。然而，色氨酸差异不必然限制该技术在单个蛋白比较中的应用。对来自同一来源的样品进行测定时，总蛋白测定是有效的。该技术可用于印迹实验中，例如用于比较印迹前后凝胶中的无染色剂信号以确定任何蛋白是否仍存在于凝胶中。通过使用蛋白的已知浓度范围构建标准曲线并评估含未知量同一蛋白的样品(前提是样品中的蛋白量在标准曲线的范围内)，该技术还可用于绝对定量。然而，在所有情况下，比较都是同一样品在一些操作前后或者不同样品中同一单个蛋白之间的直接比较。在这些情况下，不同蛋白之间色氨酸含量的任何差异都不会否定结果的有效性。在研究样品中感兴趣的单个蛋白时，有时相对于样品中一种或多种其他蛋白或者相对于样品中的全部蛋白对该蛋白量进行标准化是有益处的。标准化是一种校正实验数据的方法，以适应样品稀释、样品加载或蛋白转移不一致中的差异。例如，如果两种不同细胞培养物被用作样品，可能各培养物含有不同的细胞数目。如果两种样品中各细胞含有相同量的特定蛋白，则含有更多细胞的培养物含有更多的蛋白。在不知道一种样品所含细胞多于另一种样品的情况下，会不正确地总结出一种培养物中的平均细胞含有的蛋白多于另一种培养物中的平均细胞。标准化用于校正这类差异。最常见的标准化方法是使用管家蛋白(HKP)。作为HKP，该蛋白在所有样品中必需以大致相同的量存在。通常选择微管蛋白、GAPDH和肌动蛋白作为HKP，由于其通常缺乏与实验条件变化相关的差异。然而，许多发表物显示，选择HKP时需要持谨慎态度，因为在实验条件或样品类型变化的情况下并非所有HKP都是恒定的。基于此，通常推荐使用多种HKP以确证结果，这使western印迹实验增加了时间和复杂程度。使用HKP作为印迹标准化的方法是令人畏缩的。两种频繁使用的技术是“剥离和重新探测(strip and reprobe)”和多重荧光检测。与所使用的方法无关，使用GAPDH、肌动蛋白或微管蛋白的基于HKP的标准化需要对检测的线性范围、抗体稀释、孵育时间和成像设置进行优化。使用剥离和重新探测方法时，对感兴趣的蛋白进行探测和检测。随后使用热、去污剂或还原剂的一些组合将抗体和检测化学物质从膜上剥离下来。随后可使用HKP特异性抗体重新探测或重新检测印迹。该步骤不仅是耗时的，而且该剥离步骤会不可避免地除去一些水平的抗原，从而损害下游结果。多重荧光western印迹是一种较好的解决方案，其中可使用多种荧光标记的二抗同时探测和检测多个抗原。多重Western印迹需要上述相同的优化，但具有诸如抗体交叉反应性的其他挑战，并应在尝试多重检测前单独验证各抗原的检测的位置具有优化步骤。如果希望通过剥离和重新探测避免与使用HKP或者多重荧光印迹检测的优化相关的挑战，作为代替，可使用称作总蛋白标准化(TPN)的技术。有三种常规使用以进行TPN的方法。第一种是在分析前对样品进行蛋白测定并随后将其稀释至相同浓度以用于分析。这通常使用Bradford染色测定、二辛可宁酸(BCA)测定或其他类似方法完成。不幸的是，该方法假定该过程中没有差异，而事实通常并非如此。制备样品和将样品加载在凝胶上时的任何吸液差异都无法得到解释且该方法也无法解释凝胶和膜之间的印迹效率差异。进行TPN的另一种方法是在凝胶运行结束后对其染色。这可使用可逆染色完成，如使用结合凝胶中蛋白进行检测并可洗去的锌基或铜基染色剂以不干扰印迹过程和后续免疫检测。虽然该方法会解释样品制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使用测得的卤烷基化色氨酸荧光对目标蛋白样品中蛋白总量进行定量的方法，所述方法包括：对各个参考蛋白样品，提供所述参考蛋白样品中的蛋白总量并对从所述参考蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量；对从所述目标蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量；以及基于所述参考蛋白样品中的蛋白总量和从所述参考蛋白样品和所述目标蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光的量，对所述目标蛋白样品中的蛋白总量进行定量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.04.27 US 61/639,686;2012.04.27 US 61/639,6921.一种使用测得的卤烷基化色氨酸荧光对目标蛋白样品中蛋白总量进行
定量的方法，所述方法包括：
对各个参考蛋白样品，提供所述参考蛋白样品中的蛋白总量并对从所述参
考蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量；
对从所述目标蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量；以及
基于所述参考蛋白样品中的蛋白总量和从所述参考蛋白样品和所述目标
蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光的量，对所述目标蛋白样品中的蛋白
总量进行定量。
2.如权利要求1所述的方法，在计算机上对所述目标蛋白样品中的蛋白总
量进行定量。
3.如权利要求1所述的方法，所述目标蛋白样品含有约1000或更多种不
同蛋白。
4.如权利要求1所述的方法，所述目标蛋白样品获自血清样品、组织匀浆
或细胞裂解物。
5.如权利要求1所述的方法，所述参考蛋白样品各含有约1000或更多种
不同蛋白。
6.如权利要求1所述的方法，至少一种参考蛋白样品获自血清样品、组织
匀浆或细胞裂解物。
7.如权利要求1所述的方法，至少两种参考蛋白样品获自同一生物个体的
不同细胞或组织。
8.如权利要求1所述的方法，至少两种参考蛋白样品获自同一物种的不同
生物个体。
9.如权利要求1所述的方法，至少两种参考蛋白样品获自不同物种。
10.如权利要求1所述的方法，至少一种所述参考蛋白样品中的蛋白总
量由分光光度测量测得。
11.如权利要求1所述的方法，还包括构建使所述参考蛋白样品的蛋白
总量与卤烷基化色氨酸荧光量相关联的标准曲线的步骤，并使用所述标准曲线
对所述目标蛋白样品中的蛋白总量进行定量。
12.如权利要求11所述的方法，通过线性内插法或线性外推法对所述目
标蛋白样品中的蛋白总量进行定量。
13.一种使用测得的卤烷基化色氨酸荧光定量比较两种目标蛋白样品中
相对蛋白总量的方法，所述方法包括：
对从各目标蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量；
计算从所述目标蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量的比例；以及
基于所述比例比较所述目标蛋白样品中的相对蛋白总量。
14.如权利要求13所述的方法，在计算机上比较所述目标蛋白样品中的
相对蛋白总量。
15.如权利要求13所述的方法，从所述目标蛋白样品中检测到的卤烷基
化色氨酸荧光量的所述比例被解释为所述目标蛋白样品中总蛋白量之间的比
例。
16.如权利要求13所述的方法，各目标蛋白样品含有约1000或更多种
不同蛋白。
17.如权利要求13所述的方法，各目标蛋白样品获自血清样品、组织匀
浆或细胞裂解物。
18.如权利要求1或13所述的方法，通过获取电泳凝胶或印迹膜的部分
的图像，并测量所述图像中所述蛋白样品所引起的卤烷基化色氨酸荧光总量，
从而对从各蛋白样品中检测到的卤烷基化色氨酸荧光量进行定量，所述电泳凝
胶或印迹膜的部分包含所述蛋白样品。
19.如权利要求18所述的方法，所述电泳凝胶或印迹膜包括多条泳道，
且所述电泳凝胶或印迹膜的部分对应一条泳道。
20.如权利要求18所述的方法，通过使所述蛋白样品接触卤代烷，使所
述电泳凝胶或印迹膜暴露于UV光，并记录具有约400nm至约500nm波长的
荧光再发射光，从而获取所述图像。
21.如权利要求20所述的方法，所述卤代烷选自氯仿、三氯乙酸和三氯
乙醇。
22.如权利要求18所述的方法，所述图像中所述蛋白样品引发的卤烷基
化色氨酸荧光总量通过所述卤烷基化色氨酸荧光对所述图像的面积进行积分
来测量。
23.如权利要求18所述的方法，所述蛋白样品引发的卤烷基化色氨酸荧
光是波长为约400nm至约500nm的光，所述光在所述蛋白样品暴露于UV光
时从所述蛋白样品中发射。
24.如权利要求18所述的方法，还包括进行背景扣除步骤，包括：
从包括所述蛋白样品的所述电泳凝胶或印迹膜处获取背景图像，所述背景
图像对应于所述电泳凝胶或印迹膜中基本不含蛋白的部分；
测量所述背景图像中卤烷基化色氨酸荧光的总量或平均量；以及
从所述蛋白样品所引发的卤烷基化色氨酸荧光总量中扣除所述背景图像
中卤烷基化色氨酸荧光的总量或平均量。
25.如权利要求24所述的方法，所述背景扣除步骤在计算机上进行。...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·福瑞比，刘宁，K·麦克唐纳德，A·保勒斯，A·珀什，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US