应用MALDI‑TOFF质谱分析法的侵染性真菌感染的体外诊断方法技术

本发明专利技术涉及通过MALDI‑TOF质谱分析法用于侵染性真菌感染的体外诊断的方法。本发明专利技术包括：‑提供来自哺乳动物的生物液体样品，所述的生物样品，具体而言，包含蛋白质和/或脂质和/或盐，和/或能与所述的蛋白质和/或脂质和/或盐形成复合物的多糖和/或寡糖和/或单糖；‑处理具有生物液体的样品，以便提取所述的多糖和/或寡糖和/或单糖；‑利用MALDI‑TOF质谱分析法确定所提取的多糖,寡糖和/或单糖中是否存在来源于所述真菌微生物、且选自所述多糖,寡糖和单糖的、至少一种所关注的化合物；‑推断，如果所关注的化合物存在于所述样品中，则所述的哺乳动物正遭受侵染性真菌感染。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及应用MALDI-TOFF质谱分析法的侵染性真菌感染的体外诊断方法。本专利技术的方法还可以对包含于样品中的所关注的化合物进行定量，用作侵染性真菌感染检测的标记。酵母，例如白色念珠菌(C.albicans)常存在于健康人的黏膜中，而通常不引起特异性的疾病或症状。当身体虚弱时，所述的酵母增殖并进入血液系统，在这样的情况下会产生侵染性或全身感染(systemic infection)。就白色念珠菌而言，40％的念珠菌血症(念珠菌血症，一种由白色念珠菌引起的真菌血症)对人类是致命的。侵染性真菌疾病(IFD)或侵染性真菌感染是常见的严重性入院疾病。尽管可以有效地进行治疗，但治疗成本的攀升使得医院不堪重负，IFD的发病率也没有下降趋势。传统的真菌学方法(分离/鉴定)存在缺陷，这是由于常常没有办法无风险地接触患者感染部位取样。对于近乎一半的IFD病例，血液培养为阴性。所谓的分子生物学方法(PCR)未能解决上述的问题。此外，已证实，早期引入基于诊断的抗真菌治疗影响患者的存活率。在传统真菌学的之外的或替代性的方法中，应用检测患者血清中的循环聚糖(即，含于感染患者血清中的聚糖)的方法已被临床医生所接受。可利用商业性的免疫试验检测这些来自微生物细胞(microcetes)的细胞壁的聚糖或其前体。Candida Antigen试验可检测分别来自念珠菌属(Candida)和曲霉属(Aspergillus)的甘露聚糖和半乳甘露聚糖(galactamannans)。这些，例如牌的市售生化试剂盒可检测常见于念珠菌属和曲霉属(Aspergillus)的葡聚糖。上述两种类型的试剂盒均包含多种不同的试剂和内标。由于需要对每个批次构建校准曲线导致试剂消耗增加，尤其是对于需检测血清的情况。对校准(calibration)的需要有时可能导致因财务原因(由于试剂不足)使研究无法进行。例如，很难用确定九孔校准的应用，并且需占用技术人员半天的时间试验一个血清。这些试验还需要特定程序化的自动分析仪并具备信息系统，这些都使得应当对所提出的请求作出及时应答时，基于单个患者的紧急实际应用复杂化。因此，所有这些试验都对时间和试剂有特别的要求。此外，它们还产生一定数量干扰诊断的假阳性结果。尤其是在葡聚糖生化测定中，其受到存在的血红蛋白(收集时产生的溶血(haemolysed)血清)，或有患IFD风险的患者中常见的代谢异常(如，高甘油三酯血症，存在胆红素或低蛋白血症)的干扰。结果，有若干次报道了假阳性致使患者以真菌以外生物的多重感染而入院重症监护。检测P-D-葡聚糖中假阳性反应的机制类型未知，因为还没有从分子水平将在这些患者血清中循环的物质表征出来。由于存在假阳性结果，一些无需任何治疗的患者接受了抗真菌抗生素的治疗，使其在院时间延长。对于同样也存在的假阴性结果，被解释成细菌感染而非真菌感染，因此对患者施用抗细菌抗生素，导致患者受到伤害甚至致命。此外，试剂盒应用来自鲎的血液，鲎日益稀有，且目前无法对其进行饲养。因此，所用的鲎都是从自然界捕获的。从鲎获取血样然后将其释放，但是被释放的鲎中有20％不能存活。本专利技术的一个目的在于提供一种新的体外诊断侵染性真菌感染的方法。另一目的在于提供上述的体外方法，其更加可靠，并特别是一种有助于避免上述的假阴性和假阳性的方法。本专利技术涉及用于由病源性真菌微生物引起的侵染性真菌感染的体外方法，其特征在于：-提取由哺乳动物获得的生物液体样品中所含的多糖和/或寡糖和/或单糖，具体而言，所述的生物液体样品包含蛋白质和/或脂质和/或盐，和/或易于与所述的蛋白质和/或脂质和/或盐形成复合物的所述多糖和/或寡糖和/或单糖；-利用MALDI-TOF质谱分析法确定所提取的多糖,寡糖和/或单糖中是否存在来源于所述真菌微生物、且选自所述多糖、寡糖和单糖的至少一种所关注的化合物。-推断如果所述样品中存在所关注的化合物，则所述的哺乳动物正遭受侵染性真菌感染。本专利技术人的贡献之一是表明可以通过MALDI-TOF质谱分析法检测复杂的生物液体中，存在选自糖类，特别是多糖、寡糖和单糖的化合物，所述化合物来源于病源性微生物、而非来自宿主哺乳动物。本专利技术人的另一贡献在于，表明这一所关注的化合物是侵染性真菌感染诊断标记。通过MALDI-TOF质谱分析法获得的谱上的可见峰表示所关注化合物(标记)的存在。通过MALDI-TOF质谱分析法在生物液体中检测上述来源于病源性真菌微生物的化合物不是显而易见的。更不必说以所关注的化合物指示侵染性真菌感染。人们会以为所关注的化合物的量太少难于被检测出来，代表所述所关注化合物的信号隐藏于生物液体(特别是血清)中可见的数以千计的信号之中。而且糖类(多糖,寡糖和单糖)与生物液体中的脂质、蛋白质和盐形成复合物，因而难于被检测出来。利用来自给定的病源性真菌微生物感染的哺乳动物的生物液体样品，通过例如重复本申请中所描述的实验方案，首次鉴定出代表所关注化合物之一的显著的峰，所述的化合物用于诊断由给定的微生物引起的侵染性真菌感染。本专利技术的方法可以检测以上列出的所关注的化合物，而无需标记它们。根据本专利技术的方法，可以利用MALDI-TOF质谱分析法检测同时存在的几种所关注的化合物，其中的一种属于多糖,寡糖或单糖。根据本专利技术，也可能所关注的全部化合物都是上述的糖类。有益地，为了提取上述的所关注化合物，-通过沉淀/凝聚大多数所述蛋白质或所述脂质，解离包含于所述生物液体样品中的所述复合物；-离心所述的样品，使上清与固体组分分离；-回收上清；-通过，尤其是反向色谱法，将包含于上清液中的所关注化合物与其他的残余蛋白质和残余脂质分离，通过，尤其是吸收色谱法(absorption chromatography)，使所关注化合物与所述的盐分离。根据本专利技术，可以首先使得所关注的化合物与所述的盐分离，而后将其与残余的蛋白质和/或残余的脂质分离，或是以颠倒的次序进行上述操作。有益地，为了解离所述的复合物，向所述样品中添加络合剂(complexing agent)，尤其是碱，具体而言如EDTA，将所述的混合物加热至沸腾，具体而言加热到100℃或以上且140℃或以下，特别是接近120℃。本领域技术人员可根据样品的大小、加热技术和盛样品的容器(recipient)调整加热时间。务必使样品整体达到沸腾。调整加热时间，勿使样品尤其是其中所包含的糖类降解。例如，加热时间在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于病源性真菌微生物引起的侵染性真菌感染的体外诊断方法，其中，所述方法包括：‑提取由哺乳动物获得的生物液体样品中所含的多糖和/或寡糖和/或单糖，所述的生物液体样品包含蛋白质和/或脂质和/或盐，和/或易于与所述的蛋白质和/或脂质和/或盐形成复合物的所述多糖和/或寡糖和/或单糖；‑利用MALDI‑TOF质谱分析法确定所提取的多糖,寡糖和/或单糖中是否存在来源于所述真菌微生物、且选自所述多糖,寡糖和单糖的至少一种所关注的化合物；‑推断如果所述样品中存在所关注的化合物，则所述的哺乳动物正遭受侵染性真菌感染。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.06.26 FR 12/017961.一种用于病源性真菌微生物引起的侵染性真菌感染的体外诊断方法，
其中，所述方法包括：
-提取由哺乳动物获得的生物液体样品中所含的多糖和/或寡糖和/或单
糖，所述的生物液体样品包含蛋白质和/或脂质和/或盐，和/或易于与所述的
蛋白质和/或脂质和/或盐形成复合物的所述多糖和/或寡糖和/或单糖；
-利用MALDI-TOF质谱分析法确定所提取的多糖,寡糖和/或单糖中是
否存在来源于所述真菌微生物、且选自所述多糖,寡糖和单糖的至少一种所
关注的化合物；
-推断如果所述样品中存在所关注的化合物，则所述的哺乳动物正遭受
侵染性真菌感染。
2.权利要求1的方法，其中，为了从所述的生物样品提取所述的多糖和
/或寡糖和/或单糖：
-通过沉淀/凝聚大多数所述蛋白质或所述脂质，分离包含于所述生物液
体样品中的所述复合物；
-离心所述的样品，使上清与固相分离；
-回收上清；
-通过，尤其是反向色谱法，将包含于上清液中的所述多糖和/或寡糖和
/或单糖与残余蛋白质和残余脂质分离，通过，尤其是吸收色谱法，使所述
的多糖和/或寡糖和/或单糖与所述的盐分离。
3.权利要求2的方法，其中，为了解离所述的复合物，向所述样品中添
加络合剂，尤其是碱，具体而言是EDTA，将所述的混合物加热至沸腾，具
体而言加热到100℃和140℃之间的温度，特别是接近120℃。
4.权利要求2和3任一项的方法，其中，先进行反向色谱法，之后进行
吸收色谱法。
5.权利要求3和4任一项的方法，其中，含疏水相的柱用于反向色谱法，
含活性碳的柱用于吸收色谱法。
6.权利要求1-5任一项的方法，其特征在于，所述的所关注化合物具有
1000以下的m/z比率。
7.上述权利要求任一项的方法，其中，加入至少一种易于作用于所述

\t多糖和/或寡糖的酶，和/或进行化学处理，以切断由于所述复合物的分解所
产生的所述多糖和/或寡糖链，结果潜在地增加所述所关注化合物的量。
8.上述任一权利要求的方法，其中，所述的所关注化合物选自下述的
单体和寡聚体：[N-乙酰-氨基葡萄糖β-(1,4)N-乙酰-氨基葡萄糖]n,n是1以上
10以下的数或等于10，糖，包含2-10个糖的寡糖，具体而言是己糖寡聚体,尤
其是己糖二聚体；葡聚糖,特别是[β-(1,3)葡萄糖,葡萄糖]n,[β-(1,6)葡萄糖,葡
萄糖]n型的葡聚糖，n是1以上10以下的数或等于10；甘露聚糖，特别是[α-(1,2)
甘露糖]n,α-(1,3)甘露糖]n，α-(1,6)甘露糖]n和α-(1,2)甘露糖]n型的甘露聚
糖；其中，n是[α-(1,2)甘露糖]n,[α-(1,3)甘露糖甘露糖]n,α-(1,6)[甘露糖甘
露糖]n,甘露糖[α-(1,2)甘露糖,甘露糖]n的数，半乳聚糖,半乳甘露聚糖，阿
拉伯半乳聚糖和葡糖醛酸木甘露聚糖。
9.权利要求7的方法，其中，所述的所关注化合物是由所述病源性真菌
微生物在所述哺乳动物免疫系统的作用下产生的化合物，更具体地，是海藻
糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：D普兰，B森迪德，Y格拉德尔，N弗朗索瓦，
申请(专利权)人：里尔大学地区医疗中心，里尔法律与医疗卫生大学，里尔科学技术大学，国家科学研究中心，
类型：发明
国别省市：法国;FR