本发明专利技术公开了一株适用于工业生产硬葡聚糖的齐整小核菌，该菌株名为齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010，菌株已于2014年7月6日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO.M2014325。本发明专利技术还公开了所述齐整小核菌在发酵生产硬葡聚糖中的应用，通过采用分阶段控制发酵条件工艺，本发明专利技术实现了菌体快速生长与高效产糖的完美结合，保证的发酵过程的稳定运行，使发酵产率、生产强度可分别达到35g/L、0.44g/L/h，收率显著高于现有工艺，所制备的产品粘度高，稳定性良好，粘度变化小，具有良好的应用性能。
【技术实现步骤摘要】
一株齐整小核菌及其在发酵生产硬葡聚糖中的应用
本专利技术涉及一种微生物多糖硬葡聚糖生产菌株，尤其涉及一株齐整小核菌及其在发酵生产硬葡聚糖中的应用。
技术介绍
硬葡聚糖(也称为小核菌多糖或小核菌胶)是由丝状真菌产生的非离子水溶性同多糖。其分子是由含有β-D-(1,6)-葡萄糖残基侧链的线性β-D-(1,3)-葡萄糖残基链组成。硬葡聚糖的显著特性是良好的流变性与稳定性，其广泛的在pH(1～12)、矿化度(0～200,000ppm)和温度(130℃)均具有良好的稳定性。硬葡聚糖在食品、医药、化妆品、石油等工业都具有良好的应用价值。目前在国际市场中，硬葡聚糖作为保湿、抗炎、增稠成分普遍应用在化妆品中，常被国际知名化妆品品牌所采用。硬葡聚糖还能够提高原油采收率，在当前普遍进入三次、四次采油的趋势下，其具有广阔的应用前景。由于硬葡聚糖的发酵产率不高导致其价格居高不下，这严重限制了其市场(特别是石油工业领域)的开发拓展。因此，研究如何提高硬葡聚糖的产量是主要关注点。目前报道的关于硬葡聚糖发酵生产的研究多集中于发酵培养基的优化，但其仍然存在发酵时间长(96h以上)，产率低(20g/l左右)，生产成本较高的缺陷。虽然已公开的关于提高硬葡聚糖发酵生产的国内外专利CN201110006769.0、CN201310283916.8和EP1417325A2产率最高可达32g/L，但其工艺控制复杂，且稳定性不足。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术要解决问题是提供一株具有独特发酵规律的适用于工业化的硬葡聚糖高效发酵生产菌种——齐整小核菌及其在发酵生产硬葡聚糖中的应用。本专利技术所述适用于工业生产硬葡聚糖的齐整小核菌，其特征在于：该菌株名为齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)SCL2010，菌株已于2014年7月6日保藏在中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，简称CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学)，其保藏编号为CCTCCNO.M2014325。上述齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)SCL2010菌落形态及显微特征如下：所述菌在PDA培养基上生长快，28℃条件下培养3天，菌丝长满培养皿，菌丝茂盛，棉絮状，气生，白色。菌丝壁薄，直径2.5～6.5μm，分支，具有锁状联合。菌落边缘产生菌核，初为乳白色，后逐渐变为浅黄色至棕褐色或黑色，球形或卵圆形，大小0.5～2mm，表面光滑具光泽。对本专利技术所述齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)SCL2010测定18SrDNA的基因序列(PCR通用引物为NS1F和NS8R)的结果显示，其基因序列长度为1694bp，具体核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。其中：所述PCR通用引物NS1F和NS8R序列如下：NS1F：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’NS8R：5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’本专利技术所述的齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)SCL2010菌种选育的基本方法是：从山东省潍坊市寿光市、高密市、临朐县感染白绢病的马铃薯植株和块茎上收集白绢病菌核，以菌核为分离材料，无菌条件下将菌核接种于PDA固体培养基上培养，待菌核萌发菌丝长出后，进行分离纯化培养，转接于PDA斜面培养基上保存。将分离纯化转接于PDA培养基上的菌丝分别转接于新的PDA平板上，28℃培养连续观察，待菌丝生长铺满平板并结出菌核，直至菌核变色成熟为止，记录菌丝生长情况、结核及菌核变化情况，结合显微镜观察确定其中的齐整小核菌菌株并进行菌株编号；将已确定为齐整小核菌的菌核转接与PDA平板上，观察记录菌核萌发情况、萌发率、菌丝生长情况、结菌核时间和菌核量。选取菌核萌发快、萌发率≥75％、结菌核时间快(72h左右)、菌核量多的菌株进行硬葡聚糖摇瓶发酵实验，通过大量实验，最终获得高产硬葡聚糖的齐整小核菌，命名为齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)SCL2010菌株，该菌株菌核萌发率高达80％，发酵最终pH≤2.5，产率可达到35g/L，传代实验表明该菌株遗传稳定性良好。本专利技术所述齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)SCL2010在发酵生产硬葡聚糖中的应用。为便于发酵过程顺利实现，降低生产成本，应用方法优选的技术方案是：将齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)SCL2010经固体斜面和种子液扩大培养后，按照发酵培养液质量百分数4～10％的量接种于发酵培养液里，分阶段控制发酵条件，发酵获得硬葡聚糖。其中，所述应用方法涉及的具体步骤顺序如下：(1)硬葡聚糖生产菌种齐整小核菌茄形瓶斜面固体培养：将齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)SCL2010的成熟菌核接种于茄形瓶斜面固体培养基上，30～34℃静置培养5～7天，获得大量成熟齐整小核菌，用于发酵生产种子液制备。上述斜面固体PDA组成(单位：g/L)：马铃薯200(经水煮烂后过滤)，葡萄糖20，琼脂20。(2)硬葡聚糖发酵生产种子液制备：将培养成熟的齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)SCL2010用无菌生理盐水洗一下，按常规量接种于种子培养液里，调整种子培养液的pH至4～5，30～34℃进行通气搅拌培养30～36h，获得含大量菌丝体的硬葡聚糖发酵生产种子液。其中：所述的种子培养液由如下质量分数的组分组成(单位：g/L)：葡萄糖：10～20，酵母膏3～6，硝酸钠2～3，磷酸氢二钾2～5，硫酸镁1～3，聚醚消泡剂0.2～1，其他为软化水，pH4～5。(3)硬葡聚糖发酵生产及分阶段控制发酵条件工艺：将培养成熟的齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)SCL2010发酵生产种子液按常规量接种到含有碳源的发酵培养液中，调整培养液的pH，进行通气搅拌发酵培养，通过分阶段控制发酵条件，生产获得硬葡聚糖。其中，所述发酵培养液由如下质量百分数的组分组成(单位：g/L)：碳源：45～60，豆粕粉1～3，玉米浆0.5～2，硝酸钠1～3，磷酸氢二钾1～2，硫酸镁0.5～1，聚醚消泡剂0.2～1，其他为软化水，pH4～5。培养液中的碳源选自淀粉、蔗糖和葡萄糖中的一种或其任意重量比例的混合物。由于发酵过程分为菌体生长期与产糖期，而且随着发酵进行，发酵液粘度快速上升，因此优选的技术方案是在不同的发酵阶段进行培养温度、pH、通风比、溶解氧(DO)的阶段性控制，以有效提高发酵产率。优选的发酵控制条件是：0～24h：温度30～34℃、pH4.0～5.0、通风量0.1～0.4v.v.m.、压力为0.04～0.05MPa、溶解氧30％～50％。24h～放罐(60～72h)：温度26～28℃、pH2.5、通风量0.5～2.0v.v.m.、压力为0.04～0.05MPa、溶解氧5％～15％。应用上述方法制备的硬葡聚糖性能指标检测结果如下：(1)产率测定根据文献中一般采用的方法如下：A.所用仪器：恒温箱、分析天平(0.001g)。B.测定方法：准确量取一定体积的发酵液，调节pH至7.0，采用90％～95％的乙醇沉淀多糖，过滤后再用90％～95％的乙醇洗涤一遍，滤干后置于105℃恒温箱里干燥至恒重，降温后称重。产率＝样品干重/发酵本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株适用于工业生产硬葡聚糖的齐整小核菌，其特征在于：该菌株名为齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010，菌株已于2014年7月6日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO.M2014325。
【技术特征摘要】
1.一株齐整小核菌在发酵生产硬葡聚糖中的应用，其特征在于：所述齐整小核菌为齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)SCL2010，菌株已于2014年7月6日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO.M2014325；所述齐整小核菌在发酵生产硬葡聚糖的应用中采用分阶段控制发酵条件工艺，即：发酵0至24h时发酵条件为：温度30～34℃、pH4.0～5.0、通风量0.1～0.4v.v.m.、压力为0.04～0.05MPa、溶解氧30％～50％；发...
【专利技术属性】
技术研发人员：董学前，张永刚，武琳，吉武科，刘建军，王伟，
申请(专利权)人：山东省食品发酵工业研究设计院，
类型：发明
国别省市：山东;37
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