一种用于地沟油检测的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及一种用于地沟油检测的试剂盒，该试剂盒包括由外引物Ⅰ、外引物Ⅱ、内引物Ⅰ和内引物Ⅱ配制而成的检测引物溶液；具有链置换活性的BstDNA聚合酶；10×反应缓冲液；dNTPs溶液；阳性DNA对照样品；阴性DNA对照样品。同时本发明专利技术还公开了该试剂盒的检测方法。本发明专利技术具有高特异性，且具有快速高效、操作简便，检测成本低的特点，适合现场快速检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测试剂盒，尤其涉及。
技术介绍
地沟油是一种卫生极差，过氧化值、酸价、水分、羰基价、丙二醛、黄曲霉毒素等严重超标的非食用油。产生途径主要有以下几种:一是由下水道的一些油腻漂浮物，还有餐厨废弃油中的一些油腻物质，经过简单的加工提炼而来；还有一种是从动物内脏等组织提炼出来的油脂；其三就是经过反复油炸的油脂。地沟油中如黄曲霉素、苯并(a)芘、反式脂肪酸等各种有毒物质，长期食用对人体伤害很大，严重威胁这人类的健康。近年来，国内有关地沟油的报道以及地沟油引起的食品安全问题引起了人们的高度关注。 国外对地沟油检测方法报道较少，但由于制订一系列法规，使地沟油很难再进入食用油市场，研究主要关注废弃油脂综合利用及食用油掺伪和种类区分。 近年来，各种地沟油的检测方法层出不群，2011年12月，卫生部向社会广泛公开征集“地沟油”检测方法，共收到762份关于检验方法或检验指标的建议。其中，有281个单位和个人提交了 315项“地沟油”检测方法，组建了包括油脂加工、食品安全、卫生检验、化学分析等领域权威专家和相关机构在内的检验方法论证专家组，通过盲样测试等方式对征集到的方法进行了科学论证，发现这些方法特异性都不强。 朱旭平等通过对样品油所含的外源动物基因进行荧光定量PCR检测的方法对地沟油进行了检测。其原理为:地沟油主要是由各种潲水、用于油炸食品中的油、劣质动物肉、内脏、毛皮等加工及提炼后产出的油炼制而成，这些原料在煎炸烹饪和回收过程中往往会含有一些动物性原料，因此含有其相应的核酸成分，如猪、牛和鱼类等哺乳动物的特征基因残留。目前市面上的合格食用油多为植物油，不存在动物性基因成分。因此，通过判断样品油中是否含有动物性基因成分，就可以推断该样品油是否为地沟油，或者样品油中是否混有地沟油。该检测方法在部分样品的检测中取得较好的效果，但地沟油的来源多样、加工工艺不同，有的地沟油经过高温、粉碎、搅拌等生产处理，细胞核基因组往往被破坏，因此，该方法采用细胞核基因组基因作为检测的对象，检测的特异性不强，无法达到地沟油有效鉴定的预期目的。 专利(201110456243.2)以样品油中不应存在的动物外源成分作为地沟油的鉴别依据，以动物外源成分的线粒体特征DNA为检测的具体靶标，建立了基于此原理的荧光定量PCR扩增技术检测线粒体DNA地沟油的方法。但该方法操作繁琐、需要专门的特殊仪器，不适合现场快速检测。 LAMP技术是由日本荣研化学株式会社在2000年开发的一种新的基因扩增技术，该技术的基本特点是:①恒温扩增:整个扩增反应在恒温条件(6(T65°C)进行，不需要特殊仪器设备；②快速高效:整个扩增和产物检测可在Ih内完成；③高特异性:针对靶标序列6个区域设计4条检测引物，扩增特异性高；④高灵敏度:检测极限可低至10个拷贝或更低；⑤鉴定简便:扩增产物有多种鉴定方法，如肉眼观察或利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化、加入染料观察颜色变化等。 LAMP方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点、不需要特殊仪器，适合现场快速检测，在转基因植物检测领域具有广阔的应用前景。目前尚未有利用LAMP方法检测动物线粒体特征DNA序列、引物组，构建地沟油的检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种快速、高效的用于地沟油检测的试剂盒。 本专利技术所要解决的另一个技术问题是该用于地沟油检测的试剂盒的检测方法。 为解决上述问题，本专利技术所述的一种用于地沟油检测的试剂盒，包括一检测引物溶液:由浓度为4飞MmoI/L的外引物1、浓度为4飞MmoI/L的外引物I1、浓度为32?48 Mfl1l/L的内引物I和浓度为32?48Mfflol/L的内引物II配制而成；一具有链置换活性的Bst DNA聚合酶:浓度为7?9U/ μ L ； —1X 反应缓冲液:由 200 mmol/L 且 pH= 8.8 的 Tris-HCl，100 mmol/L KCl, 100mmol/L (NH4) 2S04,40?100 mmol/L MgSO4,6?14 mol/L 甜菜喊混合而成；—dNTPs溶液:由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；一阳性DNA对照样品:含有脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的大肠杆菌质粒DNA，或者食品中常见的猪、牛、羊、鸡、鸭和鱼的总DNA样品；一阴性DNA对照样品:不含脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的DNA。 所述脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1第I位到259位所示。 所述外引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.2第I位到18位所示。 所述外引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.3第I位到18位所示。 所述内引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.4第I位到44位所示。 所述内引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.5第I位到46位所示。 该试剂盒还包括显色剂1000XSYBR GREEN I荧光染料。 如上所述的一种用于地沟油检测的试剂盒的检测方法，包括以下步骤:⑴提取待测样品DNA:在2mL离心管I中加入400μ? TE缓冲液，然后加入食用油lmL，漩涡震荡混匀:T8min，室温下13000r/min离心5min，去除上层油脂，留下层水相，在所述离心管I中再次加入食用油lmL，颠倒混匀，离心，共重复5?20次，所得水相即为待测样品DNA ；⑵配制待测样品的LAMP检测反应体系:在200 μ L PCR反应管I内加入所述待测样品DNA 2?5 μ L、检测引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反应缓冲液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用灭菌去离子水补齐到25 μ L ；⑶配制对照样品的LAMP检测反应体系:在200 uL PCR反应管II内加入阳性DNA对照样品2?5 μ L、检测引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反应缓冲液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用灭菌去离子水补齐到25 μ L ； 在200 μ L PCR反应管III内加入阴性DNA对照样品2?5 μ L、检测引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反应缓冲液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用灭菌去离子水补齐到25 μ L ；⑷分别对所述PCR反应管1、PCR反应管I1、PCR反应管III进行LAMP扩增反应:6(T65°C孵育2(T60min，8(TC孵育5min终止反应；(5)LAMP扩增结果的鉴定:通过肉眼观察或利用浊度仪分别观察所述PCR反应管1、PCR反应管I1、PCR反应管III内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，或取2飞μ?扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；(6)当检测结果为阳性时，即判定样品为地沟油；⑴当检测结果为阴性时，若所述待测样品DNA的浓度偏差小于同等条件下市售标准油脂样品处理后的浓度的1%时，则判定样品为地沟油；⑶当检测结果为阴性时，若所述待测样品DNA的浓度与同等条件下市售标准油脂样品处理后的浓度相等时，则将所述待测样品本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于地沟油检测的试剂盒，包括—检测引物溶液：由浓度为4~6 µmol/L的外引物Ⅰ、浓度为4~6 µmol/L的外引物Ⅱ、浓度为32~48 µmol/L的内引物Ⅰ和浓度为32~48µmol/L的内引物Ⅱ配制而成；—具有链置换活性的Bst DNA聚合酶：浓度为7~9U/μL；—10×反应缓冲液：由200 mmol/L且pH= 8.8的Tris‑HCl，100 mmol/L KCl，100 mmol/L (NH4)2SO4，40~100 mmol/L MgSO4，6~14 mol/L 甜菜碱混合而成； —dNTPs 溶液：由浓度分别为10 mmol/L 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；—阳性 DNA 对照样品：含有脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的大肠杆菌质粒 DNA，或者食品中常见的猪、牛、羊、鸡、鸭和鱼的总DNA样品；—阴性 DNA 对照样品：不含脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的 DNA。

【技术特征摘要】
1.一种用于地沟油检测的试剂盒，包括 一检测引物溶液:由浓度为4飞MmoI/L的外引物1、浓度为4飞MmoI/L的外引物I1、浓度为32?48 Mfl1l/L的内引物I和浓度为32?48Mfflol/L的内引物II配制而成； 一具有链置换活性的Bst DNA聚合酶:浓度为7?9U/ μ L ； —1X 反应缓冲液:由 200 mmol/L 且 pH= 8.8 的 Tris-HCl，100 mmol/L KCl, 100mmol/L (NH4) 2S04,40?100 mmol/L MgSO4,6?14 mol/L 甜菜喊混合而成； —dNTPs溶液:由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成； 一阳性DNA对照样品:含有脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的大肠杆菌质粒DNA，或者食品中常见的猪、牛、羊、鸡、鸭和鱼的总DNA样品； 一阴性DNA对照样品:不含脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的DNA。2.如权利要求1所述的一种用于地沟油检测的试剂盒，其特征在于:所述脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1第I位到259位所示。3.如权利要求1所述的一种用于地沟油检测的试剂盒，其特征在于:所述外引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.2第I位到18位所示。4.如权利要求1所述的一种用于地沟油检测的试剂盒，其特征在于:所述外引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.3第I位到18位所示。5.如权利要求1所述的一种用于地沟油检测的试剂盒，其特征在于:所述内引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.4第I位到44位所示。6.如权利要求1所述的一种用于地沟油检测的试剂盒，其特征在于:所述内引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.5第I位到46位所示。7.如权利要求1所述的一种用于地沟油检测的试剂盒，其特征在于:该试剂盒还包括显色剂1000 X SYBR GREEN I荧光染料。8.如权利要求1所述的一种用于地沟油检测的试剂盒的检测方法，包括以下步骤: ⑴提取待测样品DNA: 在2mL离心管I中加入400μ? TE缓冲液，然后加入食用油lmL，漩涡震荡混匀:T8min，室温下13000r/min离心5min，去除上层油脂，留下层水相，在所述离心管I中再次加入食用油lmL，颠倒混匀，离心，共重复5?20次，所得水相即为待测样品DNA ； ⑵配制待测样品的LAMP检测反应体系: 在200 μ L PCR反应管I内加入所述待测样品DNA 2?5 μ L、检测引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反应缓冲液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用灭菌去离子水补齐到25 μ L ； ⑶配制对照样品的LAMP检测反应体系: 在200 uL PCR反应管II内加入阳性DNA对照样品2?5 μ L、检测引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反应缓冲液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用灭菌去离子水补齐到25 μ L ； 在200 μ L PCR反应管III内加入阴性DNA对照样品2?5 μ L、检测引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反应缓冲液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用灭菌去离子水补齐到25 μ L ； ⑷分别对所述PCR反应管1、PCR反应管I1、PCR反应管III进行LAMP扩增反应:6(T65°C孵育2(T60min，8(TC孵育5min终止反应； (5)LAMP扩增结果的鉴定:通过肉眼观察或利用浊度仪分别观察所述PCR反应管1、PCR反应管I1、PCR反应管III内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，或取2飞μ?扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果； (6)当检测结果为阳性时，即判定样品为地沟油； ⑴当检测结果为阴性时，若所述待测样品DNA的浓度偏差小于同等条件下市售标准油脂样品处理后的浓度的1%时，则判定样品为地沟油； ⑶当检测结果为阴性时，若所述待测样品DNA的浓度与同等条件下市售标准油脂样品处理后的浓度相等时，则将所述待测样品DNA转移至离心管II中； ⑶在所述离心管II中加入100 μ L 20% SDS,混匀后经65°C水浴lOmin，期间颠倒数次；然后在温度为4°C、速率为13000r/min的条件下离心10 min，得到上清液I，该上清液I移至离心管III中； (10)在所述离心管III中加入等体积的Tris和苯酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀后静置1min,室温下13000r/min离心5min,得到上清液II,该上清液II移至离心管IV中；所述苯酚-氯...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐红伟，臧荣鑫，
申请(专利权)人：西北民族大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62