脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，特别涉及脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型及其构建方法和应用。所述细胞网络模型包括原代同源的中枢神经系统毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞及神经元，按其在体内相对空间位置及数量关系进行立体化共培养，利用低氧调控系统/普通细胞培养系统和无糖细胞培养液/正常细胞培养液，模拟体内脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤时中枢神经系统中的氧糖剥夺/复氧糖环境。本发明专利技术首次提出经插件内腔中枢神经系统毛细血管内皮细胞培养液给药的药物研究模式，更符合生物体药代动力学，用于脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤产生与发展机制的深入研究，为临床诊断标志物以及药物研究与评价提供新的细胞网络模型。

【技术实现步骤摘要】
脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型及其构建方法和应用
本专利技术属于生物医药
，特别涉及一种以中枢神经系统毛细血管内皮细胞(endothelialcells,E)、星形胶质细胞(astrocytes,A)及神经元(neurons,N)所形成的原代同源三细胞四维模型为基础的脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型及其构建方法和应用。
技术介绍
脑与脊髓急性缺血性卒中具有高发病率、高死亡率、高致残率以及高复发率等特点，是严重危害人类生命与健康的重大医学问题。临床上一直通过发病后急性给药以及对高危人群预防给药的方式来干预脑与脊髓急性缺血性卒中，但收效甚微。近年来，人们对脑与脊髓急性缺血性卒中及其干预药物研究越来越多，对其产生与发展的机制也越来越明确，但与已有经典药物相比尚未取得重要突破，也并没有任何一种特效药物对大多数脑与脊髓急性缺血性卒中患者适用。实验室研究中，传统的体外细胞药物研发模型所筛选的新药虽然在基础实验阶段具有明显的作用效果，但在进入体内实验后其成功率却很低，其主要原因是脑与脊髓急性缺血性卒中的发生发展过程是一个包含了多基因、多因素、多细胞相互作用的复杂途径。目前急性缺血/再灌注损伤的体外研究模型主要为某一细胞单独培养，相关的药物研究模式更是将药物直接暴露于靶细胞，如N、A，忽略了中枢神经系统中多细胞间、细胞与间质间相互作用的系统关系，以及生物体内药物自循环系统经血脑屏障进入中枢神经系统的药物代谢途径，同体内真实情况相差甚远，甚至导致所培养细胞丧失其在体内重要的生物学特性。另一方面，如果不进行体外实验，直接进入体内动物实验，虽然能完整地保留系统的各种特征，但是过于复杂的体内环境和大量不可控因素以及动物之间的个体差异等因素将导致相关的实验结果产生偏差，这将对研究造成很大的障碍。近年来，越来越多的研究者开始重视这一问题，关于中枢神经系统体外研究模型也在不断改善，多细胞共同培养也备受关注，从最初在一个平面培养环境中将几种中枢神经系统细胞混合培养，到利用支架材料实现多细胞立体化共培养，很多研究者都做了大量的尝试。在体外培养时每一种中枢神经系统细胞的培养液和培养条件均不相同，如何能优化出一种可以提供多种不同细胞共同生长且保持原有生物学状态的培养条件是实现多种不同中枢神经系统细胞在一个空间内体外共培养的前提。目前，现有体外共培养模型的细胞来源千差万别，有些是来源于人或动物细胞系，有些是原代细胞，也有通过干细胞转化，有的是将以上几大类甚至不同种属的细胞进行共培养。此外，共培养模型的细胞种类也各不相同，目前大多选择E、A、N以及周细胞中的两种或三种。共培养模型的支架材料选择更是各式各样，其中一大类是insert插件，而目前的研究为了能获得更好的E紧密连接实验参数值，大多研究者选择孔径为0.4μm的插件，这对单纯研究E紧密连接没有问题，但是如果要在插件底外侧面加入A进行共培养时，0.4μm的孔径是无法保证A的突起可以顺利穿过的；另一大类是微流控装置，这种方式虽然能通过较少的细胞数量实现多细胞共培养，但也正因如此，很多的实验由于细胞数量过少而无法完成，更加无法模拟各种细胞在体内的相对数量关系。总而言之现有的中枢神经系统体外研究模型没有一种能更好的适用于脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤及其相关药物研究。因为在发生脑与脊髓急性缺血/再灌注时不仅仅只是N氧糖剥夺/复氧糖的变化，这一过程最重要的还有同N关系密切的A以及形成血脑屏障的E的状态改变。其中在相关药物研究中E的作用尤其重要，因为在体内任何一种药物都需要通过血液循环经血脑屏障到达中枢神经系统，而E和E间所形成的紧密连接正是构成血脑屏障的重要基础，而目前神经、精神疾病药物研究的一个瓶颈就是很多体外研究忽略了这一药代动力学过程，这主要是由于现阶段脑与脊髓急性缺血/再灌注体外研究模型无法模拟体内重要细胞相互作用、相互影响、相互制约的真实情况，而是将要药物直接作用于中枢神经系统靶细胞中，因此而产生的研究结果和体内的真实情况相差甚远，这应是为何目前的很多药物研究无法实现从体外研究到体内研究的转化的一个重要原因。基于上述原因，目前迫切需要建立一种更加接近于体内环境的脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤及其相关药物研究用体外模型。CN201310065078.7的专利技术专利公开“中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型及构建方法”，其按照体内中枢神经系统E、A和N的相对空间结构，构建了原代同源EAN三细胞四维模型。但是按照该模型的构建方法所获得的E的紧密连接程度往往偏低，无法满足损伤实验和药物研究的要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种以E、A及N所形成的原代同源三细胞四维模型为基础的脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型。本专利技术的再一目的是提供上述脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型的构建方法，以原代同源E、A及N三种重要细胞，按其在体内的相对空间位置及数量关系进行立体化共培养，利用低氧调控系统/普通细胞培养系统和无糖细胞培养液/正常细胞培养液，模拟体内脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤。本专利技术的另一目的是提供上述脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型的应用，采用经插件内腔E培养液给药方式，模拟生物体内药物自循环系统经血脑屏障进入中枢神经系统的药物代谢途径，将该模型作为药物筛选平台应用于相关防治干预研究，以解决目前研究所存在的上述技术问题。根据本专利技术的脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型，其包括原代同源的E、A及N，其中，将原代培养已经纯化的A进行胰酶消化，同时将长满E的插件从培养孔取出倒置放于无菌培养皿中，将A悬液植于插件底膜外侧面，之后该无菌培养皿置于普通细胞培养系统孵育；然后，插件翻转插入装有E完全培养液的培养孔，同时在插件内加入E完全培养液，待E和A共培养后，将E和A共培养的插件放置于已经成熟稳定的N培养孔中，既构建了基础EAN细胞网络模型，其构造如图1所示：在培养孔中插有Transwell插件，插件外腔有N完全培养液，内腔有E完全培养液；N生长于培养孔底面；所述插件底部内侧面涂有胶原蛋白Ⅳ，以模拟中枢神经系统E-A间隙基底膜蛋白层；插件底部内侧面胶原蛋白Ⅳ上层生长有E，插件底部外侧面生长有A，其突起通过插件底孔穿向E底面；其中，通过将基础EAN从普通细胞培养系统(37℃，5％CO2)中取出，在低氧调控系统中，在无糖无氧E、N培养液中、于37℃，95％N2和5％CO2混合气条件下实施氧糖剥夺处理，然后将细胞模型重新置于普通细胞培养系统内继续培养30分钟、3小时或3天，既细胞模型进入复氧糖环境，以模拟脑与脊髓急性缺血后再灌注，复氧糖的三个时间窗分别对应临床上急性缺血后再灌注的超急性期、急性期和亚急性期。根据本专利技术的脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤的细胞网络模型构建方法包括以下步骤：1、中枢神经系统原代同源基础EAN细胞网络模型(basalnetworkofthematuredbrain/spinalcapillaryendothelialcells-astrocytes-neurons,BNEAN)的构建用现有技术分别提取SD大鼠大脑皮质的E、A、N(其中A和N取自新生24小时SD大鼠，E取自成年220～280g雄性SD大鼠)并分别进行原代培养；将原代培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型，其特征在于，所述细胞网络模型包括原代同源的中枢神经系统毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞及神经元。在培养孔中插有Transwell插件，插件外腔有神经元完全培养液，内腔有中枢神经系统毛细血管内皮细胞完全培养液；神经元生长于培养孔底面；所述插件底部内侧面涂有胶原蛋白Ⅳ，以模拟中枢神经系统毛细血管内皮细胞‑星形胶质细胞间隙基底膜蛋白层；插件底部内侧面胶原蛋白Ⅳ上层生长有中枢神经系统毛细血管内皮细胞，插件底部外侧面生长有星形胶质细胞，其突起通过插件底孔穿向中枢神经系统毛细血管内皮细胞底面；其中，通过将包括中枢神经系统中毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞及神经元的细胞模型在低氧调控系统内，在无糖无氧中枢神经系统毛细血管内皮细胞和神经元培养液中、于37℃，95％N2和5％CO2混合气条件下实施氧糖剥夺处理，然后将细胞模型重新置于普通细胞培养系统中继续培养30分钟、3小时或3天，既细胞模型进入复氧糖环境，以模拟脑与脊髓急性缺血后再灌注。

【技术特征摘要】
1.一种脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型，其特征在于，所述脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤的细胞网络模型由包括以下步骤的方法构建，(1)中枢神经系统原代同源基础EAN细胞网络模型的构建(1-1)分别培养原代同源的中枢神经系统中毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞及神经元；(1-2)将原代培养后已成熟的中枢神经系统毛细血管内皮细胞种植到已包被胶原蛋白的插件底膜内侧面，插件内、外腔均为中枢神经系统毛细血管内皮细胞完全培养液，待中枢神经系统毛细血管内皮细胞长满插件底面并且形成紧密连接时，将原代培养后已经纯化的星形胶质细胞进行胰酶消化，同时取出长满中枢神经系统毛细血管内皮细胞的插件倒置放于无菌培养皿中，将星形胶质细胞悬液植于插件底膜外侧面；之后该无菌培养皿置于普通细胞培养系统孵育3小时；(1-3)插件翻转插入装有中枢神经系统毛细血管内皮细胞完全培养液的培养孔，同时在插件内加入中枢神经系统毛细血管内皮细胞完全培养液，待中枢神经系统毛细血管内皮细胞和星形胶质细胞共培养至星形胶质细胞基本长满插件底膜外腔面，将中枢神经系统毛细血管内皮细胞和星形胶质细胞共培养的插件放置于已经成熟稳定的神经元培养孔中，即构建了基础细胞网络模型，(2)脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙长凯，范明，杨晓寒，吴丽颖，郑铁铮，刘淑红，蔡楠，赵永岐，洪浩，魏盼，周孝峰，
申请(专利权)人：大连医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21