一种用于筛选高产Hib疫苗菌株的培养基、制备方法及筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种用于筛选高产Hib疫苗菌株的培养基，配方包括如下组分：酵母提取物、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、60%乳酸钠溶液、氯化镁、二水氯化钙、硫酸铵、葡萄糖、氯化血红素、辅酶I、和或琼脂；制备用于筛选高产Hib疫苗菌株培养基的方法包括称量、制备A液、制备B液和混合；通过多次在固体和液体培养基上传代生长筛选具有荚膜的高产菌株。本发明专利技术培养基不含有动物血液和动物来源的蛋白成分，避免了潜在的风险，提高了疫苗的安全性；培养基的制备方法具有操作简单、制备方便、成本低的优点；本发明专利技术的筛选方法解决了Hib疫苗规模化生产的菌种筛选问题，大大提高了Hib荚膜多糖产量，提高了工作效率、降低了生产成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于筛选高产Hib疫苗菌株的培养基、制备方法及筛选方法。
技术介绍
B型流感嗜血杆菌(Hib)是流感嗜血杆菌中具有极强侵袭力的一种，在流感嗜血杆菌引起的严重感染中，几乎90％是由B型引起的，主要引起脑膜炎、肺炎、心包炎、关节炎、菌血症、会厌炎等疾病，该病使15％至35％的存活者患有终身残疾，典型的病症有精神发育迟滞或耳聋。B型流感嗜血杆菌引起的脑膜炎、肺炎是导致精神发育迟滞或耳聋。B型流感嗜血杆菌引起的脑膜炎、肺炎是导致婴幼儿死亡的主要原因。多年流行病学研究表明，使用Hib疫苗是控制Hib侵袭性疾病的有效措施。荚膜是B型流感嗜血杆菌菌株的毒性的主要因素，它是由一系列的核糖基核糖醇磷酸酯(PRP)的重复单元组成的多糖。B型流感嗜血杆菌群落(PoPulation)常常是不均质的，有荚膜的细菌与无荚膜的细菌菌株共存。有荚膜的B型流感嗜血杆菌会在自发地发生遗传突变后丧失了表达该荚膜的能力。根据Hoiseth等人(Infectious and Immunity(1985),49:389-395)的研究，在每一细菌代中以0.1-0.3％的频率发生荚膜表达的缺失。以PRP或通过共价健连接于载体蛋白质上的PRP为基础的疫苗用于防止b型流感嗜血杆菌感染。为了制造这些疫苗，需要在大体积的培养基中生产大量的细菌，从该发酵液分离，纯化PRP。然而，有荚膜的b型流感嗜血菌株突变到无荚膜形式的容易性可构成了PRP产生的难题，因此，如何筛选出高产Hib疫苗菌株成为本领域研究的重点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种用于筛选高产Hib疫苗菌株的培养基，该培养基不含有动物血液和动物来源的蛋白成分，避免了潜在的风险，提高了疫苗的安全性；本专利技术的另一目的在于提供一种用于筛选高产Hib疫苗菌株的培养基的制备方法，该方法具有操作简单、制备方便、成本低的优点；本专利技术的再一目的在于提供一种利用此培养基筛选高产Hib疫苗菌株的方法，该方法解决了Hib疫苗规模化生产的菌种筛选问题，大大提高了Hib荚膜多糖产量，提高了工作效率、降低了生产成本。本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：一种用于筛选高产Hib疫苗菌株的培养基，所述培养基为固体培养基或液体培养基，其中，固体培养基的配方包括如下组分：相对于溶剂用量为1000ml的量，还含有酵母提取物10～20g、磷酸氢二钠3～28.65g、磷酸二氢钠0.94～3.12g、60％乳酸钠溶液0.5～1.5ml、氯化镁0.2～0.6g、二水氯化钙0.01～0.04g、硫酸铵0.5～1g、葡萄糖10～20g、氯化血红素10～20mg、辅酶I10～20mg、琼脂10～15g，调pH至6.5～7.5，所述溶剂为水；液体培养基的配方包括如下组分：相对于溶剂用量为1000ml的量，还含有酵母提取物10～20g、磷酸氢二钠3～28.65g、磷酸二氢钠0.94～3.12g、60％乳酸钠溶液0.5～1.5ml、氯化镁0.2～0.6g、二水氯化钙0.01～0.04g、硫酸铵0.5～1g、葡萄糖10～20g、氯化血红素10～20mg、辅酶I10～20mg，调pH至6.5～7.5，所述溶剂为水。一种用于筛选高产Hib疫苗菌株培养基的制备方法，所述培养基为固体培养基，制备方法包括以下步骤：S1.称量：按上述固体培养基配方比例称取各组分原料，备用；S2.制备A液：S21.超滤：将酵母提取物、葡萄糖用蒸馏水稀释，用截留分子量为10KD的膜包进行超滤，收集超滤液；S22.除菌：超滤液中加入氯化血红素和辅酶I，用孔径为0.2μm的膜过滤除菌，除菌后置于2～8℃的温度下保存；S3.制备B液：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、60％乳酸钠溶液、氯化镁、二水氯化钙、硫酸铵和琼脂混合均匀后高温高压灭菌；S4.混合：待B液冷却至55～60℃时加入A液，制得固体培养基；所述培养基为液体培养基，制备方法包括以下步骤：(1)称量：按上述液体培养基配方比例称取各组分原料，备用；(2)制备A液：A.超滤：将酵母提取物、葡萄糖用蒸馏水稀释后，用截留分子量为10KD的膜包进行超滤，收集超滤液；B.除菌：超滤液中加入氯化血红素和辅酶I，用孔径为0.2μm的膜过滤除菌，除菌后置于2～8℃的温度下保存；(3)制备B液：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、60％乳酸钠溶液、氯化镁、二水氯化钙和硫酸铵混合均匀后高温高压灭菌；(4)混合：使用前，将制备的A液、B液混合均匀即可。进一步地，所述酵母提取物稀释液的浓度为90～110g/L，葡萄糖稀释液的浓度为180～220g/L。进一步地，所述高温高压灭菌的灭菌温度为118～125℃，压强为0.09～0.12MPa，灭菌时间为28～35min。利用上述培养基筛选高产Hib疫苗菌株的方法，它包括以下步骤：S1.将Hib主种子菌种开启，吸取菌液3ml，接种于液体培养基中，36～37℃、120～240rpm的条件下培养14～20h；S2.将S1的培养基静置26～35min，吸取上清液至液体培养基中，36～37℃、120～240rpm的条件下培养8～10h；S3.将S2的培养基静置26～35min，吸取上清液划线接种于固体培养基上，在浓度为10％的二氧化碳环境下36～37℃培养14～20h；S4.挑取固体培养基上的单颗菌落，分别接种于液体培养基中，36～37℃、120～240rpm的条件下培养14～20h；S5.选择S4中固体培养基上的零散菌体，再次接种于固体培养基上，在浓度为10％的二氧化碳环境下36～37℃培养14～20h；S6.采集经S5培养后的固体培养基上的菌苔，悬浮于20～30％的甘油生理盐水，悬浮后分装，置于液氮中保存。本专利技术具有以下优点：本专利技术的一种用于筛选高产Hib疫苗菌株的培养基，该培养基不含有动物血液和动物来源的蛋白成分，避免了潜在的风险，提高了疫苗的安全性；该培养基的制备方法具有操作简单、制备方便、成本低的优点；无荚膜的Hib菌株在本专利技术的培养基中生长后会发生聚集沉淀，有荚膜的菌株在液体培养基中均匀生长，通过传代达到筛选具有荚膜的高产菌株，此筛选方法解决了Hib疫苗规模化生产的菌种筛选问题，大大提高了Hib荚膜多糖产量，提高了工作效率、降低了生产成本。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的描述，本专利技术的保护范围不局限于以下所述。实施例1：制备培养基一种用于筛选高产Hib疫苗菌株的固体培养基，配方包括如下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于筛选高产Hib疫苗菌株的培养基，其特征在于，所述培养基为固体培养基或液体培养基，其中，固体培养基的配方包括如下组分：相对于溶剂用量为1000ml的量，含有酵母提取物10～20g、磷酸氢二钠3～28.65g、磷酸二氢钠0.94～3.12g、60%乳酸钠溶液0.5～1.5ml、氯化镁0.2～0.6g、二水氯化钙 0.01～0.04g、硫酸铵 0.5～1g、葡萄糖10～20g、氯化血红素10～20mg、辅酶I 10～20mg、琼脂10～15g，调pH至6.5～7.5，所述溶剂为水；    液体培养基的配方包括如下组分：相对于溶剂用量为1000ml的量，含有酵母提取物10～20g、磷酸氢二钠3～28.65g、磷酸二氢钠0.94～3.12g、60%乳酸钠溶液0.5～1.5ml、氯化镁0.2～0.6g、二水氯化钙 0.01～0.04g、硫酸铵 0.5～1g、葡萄糖10～20g、氯化血红素10～20mg、辅酶I 10～20mg，调pH至6.5～7.5，所述溶剂为水。

【技术特征摘要】
1.一种用于筛选高产Hib疫苗菌株的培养基，其特征在于，所述培养基为固体培养基或液体培养基，其中，固体培养基的配方包括如下组分：相对于溶剂用量为1000ml的量，含有酵母提取物10～20g、磷酸氢二钠3～28.65g、磷酸二氢钠0.94～3.12g、60%乳酸钠溶液0.5～1.5ml、氯化镁0.2～0.6g、二水氯化钙 0.01～0.04g、硫酸铵 0.5～1g、葡萄糖10～20g、氯化血红素10～20mg、辅酶I 10～20mg、琼脂10～15g，调pH至6.5～7.5，所述溶剂为水；
    液体培养基的配方包括如下组分：相对于溶剂用量为1000ml的量，含有酵母提取物10～20g、磷酸氢二钠3～28.65g、磷酸二氢钠0.94～3.12g、60%乳酸钠溶液0.5～1.5ml、氯化镁0.2～0.6g、二水氯化钙 0.01～0.04g、硫酸铵 0.5～1g、葡萄糖10～20g、氯化血红素10～20mg、辅酶I 10～20mg，调pH至6.5～7.5，所述溶剂为水。
2.如权利要求1所述的一种用于筛选高产Hib疫苗菌株培养基的制备方法，其特征在于，所述培养基为固体培养基，制备方法包括以下步骤：
 S1. 称量：按上述固体培养基配方比例称取各组分原料，备用；
 S2. 制备A液：
S21. 超滤：将酵母提取物、葡萄糖用蒸馏水稀释，用截留分子量为10KD的膜包进行超滤，收集超滤液；
S22. 除菌：超滤液中加入氯化血红素和辅酶I，用孔径为0.2μm的膜过滤除菌，除菌后置于2～8℃的温度下保存；
S3. 制备B液：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、60%乳酸钠溶液、氯化镁、二水氯化钙、硫酸铵和琼脂混合均匀后高温高压灭菌；
S4. 混合：待B液冷却至55～60℃时加入A液，制得固体培养基；
所述培养基为液体培养基，制备方法包括以下步骤：
（1）称量：按上述液体培养基配方比例称取各组分原料，备用；
（2）制备A...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈道远，朱冲，陈元芬，
申请(专利权)人：成都欧林生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51