本发明专利技术涉及一种抗幽门螺杆菌及其毒素的牛初乳蛋白，其制备方法是将培养纯化的人幽门螺杆菌菌体及其毒素蛋白抗原与佐剂混合乳化后免疫注射怀孕乳牛，可诱发针对幽门螺杆菌及其毒素的特异性免疫球蛋白分泌到乳牛乳汁中，收集牛初乳，经过检测并根据现有技术加工成各型乳制品，人服用后可以减弱幽门螺杆菌在胃粘膜表面的繁殖并中和其在粘膜表面产生的毒素。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术申请涉及含抗幽门螺杆菌及其毒素特异性免疫球蛋白的牛初 乳蛋白，属于保健食品领域。技术背景1982年，澳大利亚学者巴里.马歇尔和罗宾.沃伦发现了幽门螺杆菌 (; ;;/on', HP )，并证明该细菌感染胃部会导致人的胃炎、胃 溃疡和十二指肠溃疡，从而贏得了 2005年诺贝尔医学奖。目前，许多医 院都可以通过内窥镜检查和呼气试验等诊断患者是否有幽门螺杆菌感染。 大量的临床研究报告表明，该菌在人群中的感染率很高，普通人群40% 都有这种细菌感染。虽然细菌感染以后不一定都得胃炎或者是胃溃疡，但 大量研究表明，有90%以上的十二指肠溃疡和80%左右的胃溃疡，都是 由幽门螺杆菌感染引起的。研究还发现，有幽门螺杆菌感染的人的胃癌的 发病率比没有幽门螺杆菌感染的人高20倍。幽门螺杆菌主要存在于胃粘 膜的表层或浅层，并在那里繁殖。该菌可产生空泡毒素、热休克蛋白、尿 素酶等蛋白质，这些蛋白质作为毒素可在螺杆菌繁殖的局部呈现致病作 用，促发胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡甚至胃癌的发生。可幸的是，在临 床应用中，抗生素的治疗方法已被证明能够有效治疗幽门螺杆菌感染引发 的胃炎、胃溃疡和十二指导肠溃疡等疾病。因马歇尔和沃伦的发现，彻底 改变了世人对胃病的认识，大幅度提高了胃溃疡等患者获得彻底治愈的机 会。然而，如同其它细菌可产生抗药性一样，在病人常期月良用抗菌素后幽 门螺杆菌也能产生抗药性，从而使一些抗生素在一部分病人丧失治疗作 用。因此，为了更有效地治疗和预防幽门螺杆菌感染，国内外已有不少实 验室在研究针对该菌感染的疫苗。特别是研制含有不同毒素蛋白抗原的亚 单位疫苗，这些研究还仍在初步阶段。
技术实现思路
及具体实施方式本专利技术申请的主要
技术实现思路
是将培养纯化的人幽门螺杆菌菌体及其毒素蛋白抗原与佐剂混合乳化 后免疫注射怀孕乳牛，可诱发针对幽门螺杆菌及其毒素的特异性免疫球蛋 白分泌到乳牛乳汁中，收集牛初乳，经过4企测并根据现有技术加工成各型 乳制品。由于本制品含"抗幽门螺杆菌及其毒素的牛初乳蛋白"，服用后可 以减弱幽门螺杆菌在胃粘膜表面的繁殖并中和其在粘膜表面产生的毒素。本专利技术申请中所称毒素是幽门螺杆菌培养物离心后的上清液用能截 留分子量1万左右超滤膜(如天津通海净7jc设备厂的TH-30-l超滤膜)分级 过滤，除去小分子量的内毒素，保留并浓缩分子量大于1万的各种毒素蛋 白质抗原的混合物，该混合物含有空泡毒素、热休克蛋白、尿素酶等蛋白 质，并以纯化的在大肠杆菌中表达的重组热休克蛋白作为指示抗原进行检 测。1菌种所选幽门螺杆菌只要经过鉴定、符合以下幽门螺杆菌生物学特性并具 有可诱导针对幽门螺杆菌的保护性免疫应答的VacA、 CagA、HspA、 HspB、 尿素酶和过氧化氢酶等多种抗原的菌林，如幽门螺杆菌悉尼(SS1)抹 (张延龄，张辉主编.疫苗学.科学出版社，2004年3月704 - 733 )、//./7_y/o" ATCC 43504抹(简称43504抹)、Hp Y06抹(中华微生物血和免疫学杂 志，2003,25 (10):301 - 302 )、 Hp 27抹(中华微生物血和免疫学杂 志,2007,27(4):362 )等均可用于本项专利技术。 (1)形态染色幽门螺杆菌染色体大小为1.60 1.72mb。 G+C含量为34.1%~37.5%。 它是有4 6根鞭毛的螺杆状细菌、革兰氏染色阴性、宽0.5~1.0pm、长 2.5~4.0|im、鞭毛长2 5pm。在胃粘膜中，幽门螺杆菌常常为弯曲、S形 或弧形，在胃粘液层中常呈鱼群样排列。经传代培养后，细菌往往会失去 特有弯曲状而成杆状。在细菌菌体表面有一层多糖蛋白复合物。若周围环 境不利细菌生长，如延长培养，暴露空气中，遇抗生素或细菌在不利环境 中等，幽门螺杆菌会变成圓球体， 一般认为这是细菌一种静止状态。(2 )培养特性 幽门螺杆菌属于微需氧菌。该菌营养要求高，常用气体培养条件有 85%N2, 10%<:02和5%02; 5% 10%CO2;③厌氧袋；袋内置有化学药品(枸橼酸、碳酸氢钠、硼氢钠、氯化钴)，加水激活发生反应，产生一定比例的H2和C02(袋内不力口钇)。固体培养基可选用脑心浸液、血琼脂2号、Wilkins-Chalgren和哥 伦比亚等。以上述培养基为基础，力。5%羊血、马血或人血，有报告人 血优于其他种类血源。液体培养基可选用脑心浸液加0.4。/。酵母浸液和 10%马血清。幽门螺杆菌培养时间较长需3 7天。细菌菌落l 2mm,开 始呈针尖样透明，以后菌落稍大呈灰白色，无明显溶血。在液体培养基中， 幽门螺杆菌生长呈细颗粒状，2~3天后可见细菌明显生长，易与其他细菌 区别。幽门螺杆菌最适培养温度为35 37°C。 (3 )生化反应幽门螺杆菌产生大量尿素酶，能迅速分解尿素，这是幽门螺杆菌的一 个重要特性。尿毒酶、氧化酶和过氧化氢酶阳性，这三项试验是鉴定幽门螺杆菌最 主要生化反应。其他生化反应包括不还原硝酸盐，马尿酸水解阴性，产 生碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、组氨酸氨基肽酶、亮氨酸氨基肽酶、DNA 酶及一些脂酶(C4~C12)。2免疫怀孕乳牛用幽门螺杆菌菌体及其毒素疫苗的制备(1) 幽门螺杆菌悬液的制备将幽门螺杆菌菌种接种于幽门螺杆菌 用肉汤培养基，置于分别含85%氮气、10%二氧化碳及5%氧气的混合气 体的厌氧培养箱中于35 -37。C培养3 4天后，于3000xg的离心力下将 培养液离心30min。将细菌沉淀物再悬浮于含0.5%福马林的生理盐水中 灭活细菌并洗去培养液中的内毒素，再按109菌落形成单位(cfli) /mL浓 度将其悬浮于pH7.2 PBS中重新制成悬液备用。(2) 幽门螺杆菌毒素蛋白的制备将以上1)项中幽门螺杆菌菌培 养液离心后的上清液用能截留分子量1万左右超滤膜(如天津通海净水设 备厂的TH-30-l超滤膜)分级过滤，除去小分子量的内毒素，保留并浓缩分子量大于1万的毒素蛋白质，浓缩至总蛋白量10mg/mL,备用。(3 )幽门螺杆菌菌体和幽门螺杆菌毒素蛋白混合疫苗的制备将上 述1份幽门螺杆菌菌体悬液和1份按(2)制备的幽门螺杆菌多种毒素蛋白 的混合悬液(细菌培养上清液经超滤纯化和浓缩产物)等量混合后，再分 别与等量的弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂混合并用超声波乳化后制备 成疫苗A和疫苗B用于免疫乳牛。 3怀孕乳牛的免疫注射程序第一次免疫怀孕后4 5月，分二点颈部皮下注射疫苗A,每点各 3mL。第二次免疫第一次免疫后一个月，分二颈部皮下注射疫苗B,每点 3mL。第三次免疫在分娩前一个月分2点皮下注射疫苗B，每点3mL。 4初乳的采集、加工 (1 )分娩后1 ~3天内的初乳作为有效初乳采集保存。每头乳牛每次 采集初乳用前，均应洗净乳头和乳房，再用常规消毒剂消毒后人工或机械 采集初乳。每头乳牛每次采集的初乳在检测前于4。C保存。检测后，将合 格的初乳尽快制作干份或冰冻保存。 (2)初乳的加工将抗幽门螺杆菌凝集抗体及抗毒素沉淀抗体效价合格的初乳样品按 现有常规技术制成干粉制剂。初乳蛋白干粉分装后用同位素CC)M照射灭 菌。(3 )对同位素CC^照射后的成品抽样做灭菌检验及特异性抗体的再检测。5初乳中特异性抗体的检测(1)幽门螺杆菌基因工程毒素的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种乳牛的初乳制品，其特征在于含有针对幽门螺杆菌菌体及其毒素蛋白的特异性免疫球蛋白的乳牛初乳蛋白，作为有幽门螺杆菌感染人群的保健营养品。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：崔治中，
申请(专利权)人：山东益生种畜禽有限公司，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]
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