靶向特异性补体系统抑制剂、其制备方法及应用技术方案

本发明专利技术属生物制药领域，具体涉及靶向特异性补体系统抑制剂,还包括靶向特异性补体抑制剂的设计、制备和临床应用。本发明专利技术通过能与补体成分C3激活后形成的片段C3b和/或iC3b结合而产生靶向作用的CRIg，与具有补体抑制效果的另一组分例如H因子（factor H）直接相连或利用柔性肽段（Gly4Ser）3等方式间接相连，通过基因工程等方法制备一种融合蛋白，最终达到靶向性抑制补体激活的效果。该类型药物可应用于多种与补体异常激活有关的人类疾病的治疗和预防。

【技术实现步骤摘要】
靶向特异性补体系统抑制剂、其制备方法及应用
本专利技术属于生物技术和制药领域，具体涉及靶向特异性补体抑制剂的设计、制备和临床应用。
技术介绍
补体系统是固有免疫的主要组成部分，也是获得性免疫的重要调节者，发挥着重要的免疫监视作用，不仅可以清楚入侵的病原菌微生物和宿主细胞碎片，还可以协调整个免疫和炎症过程（RicklinDetal.,NatImmunol2010;11:785-797;MorganBPetal.,Immunologyletters2005;97:171-179）。补体可通过经典途径、替补途径及凝集素途径激活，其发挥生理功能主要通过激活后形成的产物进行，包括C3b/iC3b沉积于被攻击细胞膜表面，招募单核细胞等免疫效应细胞通过吞噬作用而清除靶细胞；C3a/C4a/C5a等过敏毒素引起局部炎症；以及补体膜攻击复合物（MembraneAttackComplex,MAC，即C5b-9n）在靶细胞膜表面形成孔洞而最终裂解靶细胞。在此过程中，为了防止补体激活后对正常宿主细胞的“误伤”效应，机体在进化过程中形成了10余种调控蛋白，包括存在于血液循环中的C1-INH（C1inhibitor，C1抑制蛋白）、C4BP（C4bindingprotein，C4结合蛋白）、factorI（I因子）、factorH（H因子）、S-protein（S蛋白）和Clusterin（簇集蛋白）；以及表达与细胞膜表面的补体膜调控蛋白CD35/CR1、CD46/MCP、CD55/DAF和CD59（Zhou,X.,etal.,TheOncologist2008;13:954-966），以及近期发现的另一种补体膜调控蛋白CRIg（HelmyKYetal.,Cell.2006;124:915-927;WiesmannCetal.,Nature,2006,444:217-220），在补体酶级联反应的不同阶段抑制补体的激活，使得补体系统在激活和抑制之间维持一种精妙的平衡，机体处于健康状况。但是，这种平衡一旦被打破，人体的很多疾病的发生、发展和治疗均与此密切相关，例如大量研究表明，补体系统的过度激活不同程度不同阶段参与其他疾病的发生与发展，例如自身溶血性贫血、自身免疫性血小板减少、再生障碍性贫血、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、动脉粥样硬化、帕金森氏病、阿尔茨海默病（老年性痴呆）、哮喘、过敏、银屑病、重症肌无力、多发性硬化、克隆氏肠病等。因此，以补体系统为治疗靶点的药物研发，包括补体系统抑制剂重新受到重视（RicklinDetal.,NatImmunol2010;11:785-797），研发补体系统抑制剂，尤其是靶向性抑制剂具有巨大的社会和经济价值。研发补体系统抑制剂在领域内经过了数十年的探索，包括与C3结合的蛋白质Compastatin（GeorgopoulosLJ,etal.,MolImmunol,2009;46:2911-7）以及抗C5的重组单抗Eculizumab（依库珠，Soliris，由亚力兄制药公司AlexionPharmaceuticals生产）（RotherRPetal.,NatBiotechnol,2007;25:1256-1264），但仍然存在一些明显的不足。Compastatin已经进入临床前期试验，但是由于抑制所有部位C3的功能而存在潜在的导致感染的风险。另外，尽管依库珠已经成功用于治疗治疗阵发性睡眠性（夜间）血红蛋白尿（ParoxysmalNocturnalHemoglobinuria，PNH），但知识产权为国外拥有，价格异常昂贵，使用一年的价格是409,500美元，2009年，Soliris销售额为2.95亿美元，2010年销售额5.41亿美元。PNH是一种后天获得性溶血性疾病,主要由于PIG-A基因的突变导致CD55和CD59这两种正常通过糖基磷肌酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol,GPI）锚定于红细胞膜上的补体膜调控蛋白不再锚定于PNH患者的血细胞膜上,所以PNH患者的血细胞对补体的攻击异常敏感，极易产生白细胞下降导致的感染、红细胞破裂造成的溶血，以及血小板被激活，最终导致反复感染、溶血、血栓形成、肾功能衰竭、骨髓衰竭和肺动脉压升高等，疾病进行性加重，在依库珠单抗出现之前基本无药可治，从而严重威胁患者的生命（ParkerCetal.,Blood,2005;106:3699-3709）。依库珠的作用机理是与C5结合后，在补体级联反应的末期抑制补体的激活，从而阻止MAC在血细胞膜上的沉积和对血细胞尤其是对红细胞的裂解，临床上对PNH患者的治疗收到了较好的疗效，显著减少血栓形成，66%的患者在治疗一年内不需再输血（KellyRJetal.,Blood,2011;117:6786-6792）。然而，理论上应用依库珠单抗后PNH患者的病情仍然无法得到完全缓解，因为补体级联反应的C3水平仍然存在激活，产生C3b/iC3b并沉积与血细胞表面，使这些血细胞被单核细胞吞噬，最终造成血管外溶血（RisitanoAMetal.,Blood,2009;113:4094-4100），这也是依库珠单抗治疗并不十分满意的原因。因此，在补体激活更早期的C3水平，而不是像依库珠单抗的末期C5水平，阻止补体的激活，将有效同时阻止MAC介导的血管内和C3b/iC3b介导的血管外溶血，从而产生更好的疗效。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种靶向特异性补体抑制剂。本专利技术的另一个目的是提供上述靶向特异性补体抑制剂在制备抑制补体激活药剂中的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术经过数以千记的实验和反复的测试，发现CRIg可以用于作为本专利技术靶向特异性补体抑制剂的基础。CRIg最早发现表达于巨噬细胞膜表面的一种C3b/iC3b受体，结合后可吞噬病原体或其他颗粒（HelmyKYetal.,Cell.2006;124:915-927）。进一步结构生物学研究还发现CRIg可通过特异性识别C3b并抑制C3转换酶的激活，从而在补体级联反应的早期即产生抑制效应——这种抑制作用为针对补体的替补激活途径，但其抑制效果低于经典的补体替补途径抑制剂factorH；同时，CRIg的功能位点位于胞外区（WiesmannCetal.,Nature,2006,444:217-220）。查阅发现至今未有CRIg用于补体抑制的应用报道，更未有利用其与C3b/iC3b结合的特性研发靶向性补体抑制剂的报道。本专利技术利用CRIg这两种独特的特性，克隆其胞外功能区基因并与其他补体调控蛋白融合表达，制备成一种通过CRIg与C3b/iC3b特异性结合的靶向作用，把重组联接的补体调控蛋白运送至局部补体激活部位，从而达到抑制补体激活，预防或治疗疾病的目的。CRIg的胞外功能部位的基因序列见序列表的SEQIDNO9，氨基酸序列见序列表SEQIDNO10。另外，与CRIg相连的其他部分包括所有能抑制补体激活的成分，例如补体调控蛋白C1-INH、C4BP、factorI、factorH、S-protein、Clusterin、CD35/CR1、CD46/MCP、CD55/DAF和CD59、甚至CRIg本身等的全长或部分序列，其中相连的方式包括直接相连，以及通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质，其特征在于，该蛋白质具有靶向抑制补体激活的功能，并且该蛋白质的氨基酸序列（a）含有CRIg胞外功能区和补体抑制功能区；或者（b）由CRIg胞外功能区、补体抑制功能区以及两者间的连接物组成；上述补体抑制功能区是factor H、C1‑INH、C4BP、factor I、S‑protein、Clusterin、CD35/CR1、CD46/MCP、CD55/DAF、CD59或者CRIg的功能片段或全长。

【技术特征摘要】
2013.09.05 CN 201310400969.31.一种蛋白质，其特征在于，该蛋白质具有靶向抑制补体激活的功能，并且该蛋白质的氨基酸序列(a)含有CRIg胞外功能区和补体抑制功能区；或者(b)由CRIg胞外功能区、补体抑制功能区以及两者间的连接物组成；上述补体抑制功能区是factorH；该蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO2或者SEQIDNO4所示。2.一种核酸，其特征在于，该核酸序列编码权利要求1所述的蛋白质；该核酸的碱基序列如SEQIDNO1或者SEQIDNO3所示。3.一种载体，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡维国，乔倩，张鑫，
申请(专利权)人：复旦大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：上海;31