基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法技术

本发明专利技术公开一种基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法，其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳，新生成的氨能提高体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，可以用于脲酶活性的测定。在2.2~44U/L范围内F650与脲酶浓度呈线性关系，检测限为0.55U/L。本发明专利技术灵敏度高，重现性好，可用于幽门螺旋杆菌的测定。

【技术实现步骤摘要】
基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法
本专利技术涉及以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针的脲酶活性测定方法，属于分析化学及纳米

技术介绍
脲酶（urease）是一种含镍的寡聚酶，它能高效、特异性催化尿素水解生成二氧化碳和氨。医学上，细菌脲酶是一种不容忽视的致病因素，它可诱发许多疾病，如肾盂肾炎、肝昏迷、消化性溃疡和感染性尿路结石等。农业上，当土壤脲酶的活性过高时，化肥中的尿素被迅速分解生成氨，排放到大气中，造成经济损失及环境污染。另外，豆类制品如豆奶、代乳粉等，如含有脲酶对人体有害，会引起腹泻等症状，故在制造工艺中，要除去脲酶。由上可见，脲酶活性的测定在医学、农业和食品等领域具有重要的意义。金纳米团簇（goldnanoclusters,AuNCs）是一种新型的荧光纳米材料，由几个到几百个原子组成，尺寸接近于电子的费米波长（约0.7nm）。由于量子尺寸效应，金纳米团簇显示出独特的光学特性。荧光金纳米团簇具有尺寸小、无毒、水溶性好、光稳定性好、Stokes位移大、比表面积大、制备条件温和、表面易于修饰以及荧光性质随尺寸可调等突出优点，是近年来的研究热点，其已被广泛应用于催化、传感检测、纳米标记、医学成像和光电子学等领域。本专利技术以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇作为荧光探针，提供了一种简便、灵敏的脲酶检测新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光pH探针的脲酶活性测定方法。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术所述的基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法，其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳的体系，新生成的氨能提高所述体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，能用于脲酶活性的测定。所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将浓度为0.02~0.18mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0.1~0.8mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0.01~0.1g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于20~70°C水浴恒温反应0~3.5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6mL浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液与0.4mL浓度为0.02g/L的氯金酸溶液加入到4mL浓度为0.08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。利用N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇在650nm处的发射光强度值（F650）以判断脲酶含量，所使用的激发波长为355nm。将不同浓度pH=6.0的脲酶溶液加入到0~2.5mol/L、pH=6.0的尿素溶液中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应0~50min，测定发射光强度值F650，在脲酶浓度为2.2~44U/L的范围内其发射光强度值F650与脲酶浓度呈线性关系，检测限为0.55U/L。所述尿素的浓度优选为1mol/L，反应时间优选为40min。金纳米团簇溶液，脲酶溶液和尿素溶液按体积比为4：1：4混合，反应总体积为0.45mL。本专利技术所述的基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法，包括如下步骤：取适量人胃组织，加入2mL浓度为1mol/L、pH=6.0的尿素溶液中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应40min，取0.25mL上述反应液，加入0.2mLN-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液，在25°C的恒温水浴槽中反应3min，测定发射光强度值F650以定性判断胃组织是否存在幽门螺旋杆菌。所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6mL浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液与0.4mL浓度为0.02g/L的氯金酸溶液加入到4mL浓度为0.08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。具体地说，本专利技术采用的技术方案为：（一）金纳米团簇荧光材料的制备以下过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。金纳米团簇荧光材料的制备方法如下：将0.6mL浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液与0.4mL浓度为0.02g/L的氯金酸溶液加入到4mL浓度为0.08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5小时，反应液由浅黄色变为无色。反应结束后用分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。（二）脲酶活性的测定：脲酶活性的测定分两步进行：（一）将0.05mL脲酶样品溶液（pH=6.0缓冲液溶解）加入到0.2mL浓度为1M的尿素溶液（pH=6.0）中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应40min；（二）将0.2mL的金纳米团簇溶液加入到第一步反应后的溶液中，在25°C的恒温水浴槽中反应3min，在355nm激发波长下测定650nm处的荧光强度值（F650），通过标准曲线进行脲酶活性的测定。本专利技术的优点：（1）本专利技术基于脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳，新生成的氨能提高体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，可以用于脲酶活性的检测。（2）本专利技术所使用的金纳米团簇直接由N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸得到，无需进行进一步的修饰，制备过程简单快速。（3）本专利技术的检测灵敏度高，荧光分光光度计测定的检测限为0.55U/L。附图说明图1为金纳米团簇溶液在紫外灯下的外观图。图中：（A）空白对照组；（B）脲酶组（脲酶浓度为22U/L）。图2为金纳米团簇溶液的发射光谱图。图中：（A）空白对照组，为上方的曲线；（B）脲酶组（脲酶浓度为22U/L），为下方的曲线。图3为不同浓度尿素条件下金纳米团簇溶液与脲酶催化反应液（脲酶浓度为22U/L）作用后发射光强度（F650）变化值（ΔF650）关系图。图4为在金纳米团簇溶液中加入脲酶和尿素后，荧光发射光强度随时间的变化图。图5为金纳米团簇溶液与脲酶催化反应液（含不同浓度脲酶）作用后的荧光发射光谱图。图6为金纳米团簇溶液的发射光强度值（F650）与脲酶浓度之间的关系图。图7为金纳米团簇溶液的发射光强度值（F650）与脲酶浓度之间的线性关系图。图8为金纳米团簇溶液用于胃组织幽门螺旋杆菌测定结果图。具体实施方式实例1：将0.6mL浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液与0.4mL浓度为0.02g/L的氯金酸溶液加入到4mL浓度为0.08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法，其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳的体系，新生成的氨能提高所述体系的pH值，使N‑乙酰‑L‑半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，能用于脲酶活性的测定。

【技术特征摘要】
1.一种基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法，其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳的体系，新生成的氨能提高所述体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，能用于脲酶活性的测定；所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将浓度为0.1~0.8mol/L的氢氧化钠溶液和浓度为0.01~0.1g/L的氯金酸溶液加入到浓度为0.02~0.18mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C水浴恒温反应2.5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。2.根据权利要求1所述的基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6mL浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液与0.4mL浓度为0.02g/L的氯金酸溶液加入到4mL浓度为0.08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5小时，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。3.根据权利要求1所述的基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法，其特征是利用N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇在650nm处的发射光强度值（F650）以判断...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈伟，邓豪华，吴钢伟，刘银环，彭花萍，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：福建;35