一种菲律宾蛤仔寡肽的制备方法及其在抗前列腺癌中的应用技术

本发明专利技术涉及一种菲律宾蛤仔寡肽，其氨基酸序列为Asp-Trp-Pro-His，公开了该种寡肽的制备方法，即利用胰蛋白酶酶解获得目标寡肽酶解液，再经超滤、阴离子交换、及反相高效液相色谱进一步分离纯化获得目标寡肽；同时还公开了该种寡肽在抗前列腺癌中的应用，具体的，可有效抑制体外培养前列腺癌PC-3、DU-145细胞生长，诱导凋亡，改变细胞周期。与现有技术相比，本发明专利技术制备菲律宾蛤仔寡肽的方法，工艺过程简单，杂质少，效率高，同时在现有技术的基础上，揭示了该种寡肽在抗前列腺癌上的效用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种菲律宾蛤仔寡肽，其氨基酸序列为Asp-Trp-Pro-His，公开了该种寡肽的制备方法，即利用胰蛋白酶酶解获得目标寡肽酶解液，再经超滤、阴离子交换、及反相高效液相色谱进一步分离纯化获得目标寡肽；同时还公开了该种寡肽在抗前列腺癌中的应用，具体的，可有效抑制体外培养前列腺癌PC-3、DU-145细胞生长，诱导凋亡，改变细胞周期。与现有技术相比，本专利技术制备菲律宾蛤仔寡肽的方法，工艺过程简单，杂质少，效率高，同时在现有技术的基础上，揭示了该种寡肽在抗前列腺癌上的效用。【专利说明】一种菲律宾蛤仔寡肽的制备方法及其在抗前列腺癌中的应 用
本专利技术涉及一种菲律宾蛤仔寡肽，尤其涉及这种菲律宾蛤仔寡肽的制备方法及其 在抗前列腺癌领域中的应用。
技术介绍
菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum)属软体动物门双壳纲帘蛤目帘蛤科，一 种广温性的小型双壳贝类，南方俗称花蛤，与牡蛎、缢蛏、蚶类并列为我国四大养殖贝类，是 近岸滩涂和浅海的主要贝类之一，其味道鲜美，营养丰富，蛋白含量高。 研究表明，菲律宾蛤仔提取物具有很多生理功效，如抗肿瘤、抗氧化、抑菌和增强 免疫力等，近年来对菲律宾蛤仔提取物的抗肿瘤研究有很大进展，如范秀萍等(食品工业 科技，2003)利用菲律宾蛤仔糖胺聚糖的粗制品（CRG)作用于体外培养的HL-60细胞，发 现CRG在I. Omg/ml浓度下对HL-60细胞具有显著抑制作用，在24h、48h、72h抑瘤率分别 可达59. 8%、67. 7%和96. 2%。张莉等(海洋与湖沼，2007)利用菲律宾蛤仔肉提取两种蛋白 聚糖PGl和PG2,其中PGl在200ug/ml浓度时对人肝癌细胞SMMC7721的生长抑制率达到 73. 30%，且不影响人正常肝细胞HL-7002的生长与功能。前列腺癌是男性最常见的恶性肿 瘤之一，在欧美国家由前列腺癌导致的死亡人数占恶性肿瘤引起死亡人数的第二位，仅次 于肺癌。近年来随着人民平均寿命的延长和诊断技术的提高，我国前列腺癌的发病率呈显 著增长的趋势，已经严重影响着我国50岁以上男性的生活质量和寿命，成为泌尿外科领域 一个越来越重要的研究课题，但关于菲律宾蛤仔活性提取物对前列腺癌癌细胞抑制作用的 报道较少，且关于菲律宾蛤仔活性肽的抗前列腺癌上的应用的更少。 目前，生物活性肽的制备主要有三种方式：一是从自然界的生物体中提取其本身 固有的各种天然活性肽类物质；二是通过蛋白质降解的途径获得具有各种生理功能的生 物活性物质；三是利用生物合成的方法来制备生物活性肽。其中，第一种方式中自然界生 物体重活性肽类物质的含量较低，提取过程中产率较低，且需要较多的原料个体，使得成本 较高；第三种方式中生物合成的过程复杂难控，中间产物较多，不适合大规模产生；综合而 言，由于蛋白酶的酶解特异性和高效性，使得酶解法制取生物活性肽的方法安全性高，产率 商。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种利用蛋白酶酶解法制备 菲律宾蛤仔寡肽的方法。 本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供该种菲律宾蛤仔寡肽在抗前列腺癌中 的应用。 本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种菲律宾蛤仔寡肽的制备方 法，其特征在于包括以下步骤 ： ①将菲律宾蛤仔洗净，取肉后加超纯水搅拌，然后去杂质匀浆，制得匀浆样品； ②取适量的所述匀浆样品，加入适量体积的超纯水，此时原料与超纯水的比值为 1:1?1:4,加入蛋白酶在水浴箱中进行酶解反应，其中加酶量为300ug?1500ug，酶解反 应的pH值为8?9,酶解时间为4h?12h，酶解温度为40°C?60°C ; ③酶解反应结束后灭活、离心、取上清液备用； ④将所述上清液加入超滤膜中进行超滤，收集分子量小于3KDa的酶解物质进行 冷冻干燥备用； ⑤利用DEAE S印haroseFF阴离子交换，采用磷酸缓冲液和NaCl溶液对所得酶解 液进行阶段洗脱，在280nm波长处收集最高肽峰冷冻干燥后贮存备用； ⑥将DEAE S印haroseFF阴离子交换收集的最高肽峰利用反相高效液相色谱法进 行进一步纯化，在220nm波长处出现唯一峰，收集该峰，冷冻干燥制得所述菲律宾蛤仔寡 肽。 作为优选，所述原料与超纯水的比值为1:2,这样可使原料在水溶液中充分分离， 在不过分稀释蛋白酶浓度的前提下，增加了蛋白酶与酶解对象的接触面积，提高了酶解效 率，同时也可保证原料的生物活性。 所述蛋白酶可有多种选择，作为优选，所述蛋白酶为胰蛋白酶，且蛋白酶的最佳酶 解条件组合为：加酶量为1200ug，酶解pH值为8. 0,酶解时间为8h，酶解温度为50°C。 作为优选，所述步骤③中为沸水浴中灭活15min，4°C下10000r/min离心15min，沸 水浴即KKTC可使蛋白酶充分灭活，且4°C下高速离心可保证酶解液中相关物质的生物活 性。 所述步骤⑤中NaCl溶液的浓度为0· lmol/L、0. 3mol/L、0. 5mol/L三种，可对酶解 液分阶段进行充分洗脱。 所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为C18反相柱，填料为0DS，流动相为乙 腈与水（15:85)，流速为0.81111.1^11_ 1，上样体积为2〇111，检测波长为22〇11111，洗脱条件为15% 乙腈,20min。 由上述方法所得的菲律宾蛤仔寡肽的氨基酸序列为Asp-Trp-Pro-His,该种菲律 宾蛤仔寡肽在抗前列腺癌中的应用，尤其能抑制体外培养前列腺癌PC-3、DU-145细胞的生 长，作用24h后，PC-3、DU-145细胞的早、晚期凋亡细胞便开始增多，且随着药液浓度的增 力口，凋亡细胞逐渐增多。 与现有技术相比，本专利技术的优点在于：利用胰蛋白酶酶解获得目标寡肽酶解液，再 经超滤、阴离子交换、及反相高效液相色谱进一步分离纯化获得目标寡肽，工艺过程简单效 率高，且获得的目标寡肽具有抗前列腺癌活性，可有效抑制体外培养前列腺癌PC-3、DU_145 细胞生长，诱导凋亡，改变细胞周期。 【专利附图】【附图说明】 图1为实施例1中温度对胰蛋白酶酶解液中ANN含量和腥味值影响关系示意图； 图2为实施例1中时间对胰蛋白酶酶解液中ANN含量和腥味值影响关系示意图； 图3为实施例1中pH对胰蛋白酶酶解液中ANN含量和腥味值影响关系示意图； 图4为实施例1中加酶量对胰蛋白酶酶解液中ANN含量和腥味值影响关系示意 图； 图5为实施例2中DEAE-s印haroseFF洗脱峰示意图； 图6为图5中峰I1经RP-HPLC色谱柱洗脱纯化结果示意图； 图7为目标寡肽氨基酸分子结构示意图； 图8为实施例3中PRO对PC-3细胞的增殖抑制作用柱状图； 图9为实施例3中DU-145对PC-3细胞的增殖抑制作用柱状图； 图10为实施例3中对照组PC-3细胞Α0/ΕΒ染色结果示意图； 图11为实施例3中PC-3细胞经10mg/mL PRO作用24h后Α0/ΕΒ染色结果示意 图； 图12为实施例3中PC-3细胞经20mg/mL PRO作用24h后Α0/ΕΒ染色结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种菲律宾蛤仔寡肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：①将菲律宾蛤仔洗净，取肉后加超纯水搅拌，然后去杂质匀浆，制得匀浆样品；②取适量的所述匀浆样品，加入适量体积的超纯水，此时原料与超纯水的比值为1:1～1:4，加入蛋白酶在水浴箱中进行酶解反应，其中加酶量为300ug～1500ug,酶解反应的pH值为8～9，酶解时间为4h～12h，酶解温度为40℃～60℃；③酶解反应结束后灭活、离心、取上清液备用；④将所述上清液加入超滤膜中进行超滤，收集分子量小于3KDa的酶解物质进行冷冻干燥备用；⑤利用DEAE SepharoseFF阴离子交换，采用磷酸缓冲液和NaCl溶液对所得酶解液进行阶段洗脱，在280nm波长处收集最高肽峰冷冻干燥后贮存备用；⑥将DEAE SepharoseFF阴离子交换收集的最高肽峰利用反相高效液相色谱法进行进一步纯化，在220nm波长处出现唯一峰，收集该峰，冷冻干燥制得所述菲律宾蛤仔寡肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨最素，徐律，丁国芳，孙瑜，黄芳芳，郁迪，李连军，
申请(专利权)人：浙江海洋学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33