本发明专利技术涉及一种检测G-蛋白耦联受体对缩血管物质反应的方法，包括将实验动脉血管分成高血压患者大网膜动脉组、非高血压患者大网膜动脉组、SHR肠系膜动脉组和WKY大鼠肠系膜动脉组四组；累加浓度法加入去甲肾上腺素测定动脉环张力的变化，作量效曲线，考察α受体介导的收缩功能；同理分别加入5-羟色胺、蛇毒类似物、内皮素三种物质，依次考察5-HT、ETB、ETA三受体介导的收缩功能，用双因素方差分析和T检验考察显著性。该发明专利技术方法操作简单、高效，结果准确，且对环境友好。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种检测G-蛋白耦联受体对缩血管物质反应的方法，包括将实验动脉血管分成高血压患者大网膜动脉组、非高血压患者大网膜动脉组、SHR肠系膜动脉组和WKY大鼠肠系膜动脉组四组；累加浓度法加入去甲肾上腺素测定动脉环张力的变化，作量效曲线，考察α受体介导的收缩功能；同理分别加入5-羟色胺、蛇毒类似物、内皮素三种物质，依次考察5-HT、ETB、ETA三受体介导的收缩功能，用双因素方差分析和T检验考察显著性。该专利技术方法操作简单、高效，结果准确，且对环境友好。【专利说明】一种检测G-蛋白耦联受体对缩血管物质反应的方法
本专利技术涉及一种检测方法，具体涉及一种检测G-蛋白耦联受体对缩血管物质的反应的方法。
技术介绍
高血压是严重危害人类健康的常见病。心排出量和外周血管阻力是血压形成的基本因素，而神经-体液在维持血压稳定中起重要作用，因此，神经-体液紊乱将导致高血压病的发生与发展。高血压时表现机体缩血管物质水平增加，如交感神经活性增高释放递质去甲肾上腺素(noradrenaline, NE)增加,血管内皮分泌内皮素增加，肾素-血管紧张素系统活性增高促进血管紧张素II生成，缩血管的反应性增强，引起血管外周阻力增高和心血管重构，导致高血压的发生和发展。G蛋白耦联受体是与GTP结合蛋白耦联的一组膜表面结合蛋白，是目前已发现的种类最多的一类受体，广泛分布于各组织和器官，血管上的主要受体如肾上腺素受体、血管紧张素II受体、胆碱能受体、5-羟色胺(5-hydroxytryptamin，5-HT)受体、内皮素受体等均属G-蛋白耦联受体。报道中少见动物主要阻力血管，未见高血压病人大网膜动脉对NE、5-HT、Sarafotoxin 6c(S6c, ETb受体选择性激动剂)和内皮素-1 (endothelin-l, ET-1)的缩血管反应。
技术实现思路
I材料与方法 1.1动脉环的准备 原发性高血压患者(η = 6，收缩压SBP 150-160mmHg，舒张压DBP 90-100mmHg,年龄45-64岁，4名男性，2名女性，高血压病史6-10年)，血压正常的患者(η = 8，SBP110-130mmHg, DBP 60_80mmHg，年龄30-54岁，4名男性，3名女性)，患者手术原因为急性阑尾炎、急性胰腺炎或者急性肠梗阻，手术室取出大网膜动脉，立即浸入冷Krebs液(含mM:NaCl 119、NaHC0315、KCl 4.6、MgCl2l.2、NaH2P04l.2、CaCl2l.5 和葡萄糖 5.5) ；SHR(n =16，尾动脉压204±16mmHg)，WKY大鼠(η = 16，尾动脉压110± IlmmHg)(上海思莱克实验动物公司)均为20周龄，体重250-300g，大鼠乙醚麻醉后断头处死，迅速取出肠系膜动脉，立即浸入冷Krebs液，显微镜下剥离血管周围组织，0.1 % Triton x_100血管内灌注10s，去除血管内皮，再用缓冲液冲洗10s，当乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)引起的舒张率< 10%，认为内皮已被去除，将处理好的血管切成Imm长的圆环[2’气患者每份标本取9个血管环，大鼠每份标本取8个血管环。手术前征求了患者同意并填写知情同意书，实验得到了伦理学会的批准。 1.2药物和试剂 去甲肾上腺素(NE)，普萘洛尔(propranolol, Prop)，乙酰胆碱(ACh)，5_轻色胺(5-HT),内皮素-1 (ET-1)、Sarafotoxin 6c (S6c),哌唑嗪(Prazosin)，萝芙素(Rauwolscine),酮色林(Ketanserin)均为Sigma公司产品，由瑞典隆德大学提供。以上试剂溶于0.1 %的牛血清白蛋白，临用以Krebs液稀释。浓度以浴槽中最终药物的浓度表示。 1.3主要仪器 PowerLatT:数据记录和分析系统，包括软件Chart5.0以及硬件8通道桥式放大器(ADInstruments Co, Australia) ;FT03C*张力换能器(Grass Instrument C0.Quincy,Mass., U.S.A) ;Myograph*恒温浴漕(DMT, Denmark)。 1.4体外实验方法建立 将血管环套在两个L型的金属针上，其中一个连接FT03CT张力换能器，另一个连微调装置(可以调节负荷张力)，通过软件Chart5.0以及硬件PowerLab 8通道桥式放大器，将血管所负荷张力显示于屏幕。将安装好的动脉环置入含有2.5ml Krebs液的370C Myographl亘温浴槽，持续通入含95% O2和5% CO2的混合气体，pH保持7.4。实验前，动脉环静息负荷2mN，每20min换液一次，稳定1.5h。以K+-Krebs液(含K+63.5mM)检验动脉环收缩性，两次收缩高度大于ImN且收缩幅度相差< 10%者用于实验。K+-Krebs液组成为(mM =NaCl 60、NaHC0315、KCl 63.5、MgCl2L 2、NaH2PO4L 2、CaCl2L 5 和葡萄糖 5.5) 。 先用Prop(10_9M)于浴槽中孵育血管半小时阻断β受体，再浓度累加法加入NE (ΙΟ-11?I(T4M)，考察α受体功能；先分别用Prop与不同浓度哌唑嗪(ΙΟ-11?I(T8M)或不同浓度萝芙素(10_7?I(T5M)孵育血管半小时，再浓度累加法加入NE，分别考察a JP α2受体功能。浓度累加法加入5-ΗΤ(10-η?I(T4M)，考察5-ΗΤ受体功能；先分别用不同浓度酮色林(I,?I(T8M)孵育血管半小时，再浓度累加法加入5-ΗΤ，考察5-ΗΤ2Α受体功能。先浓度累加法加入S6c (10_13?I(T6M)，选择性激动ETb受体，考察ETb受体功能，收缩作用达到最大，等待ETb受体内化，收缩曲线逐渐降至基线水平并稳定30min后，累加浓度法加入ET-1 (10_13?10_6M)，考察ETa受体功能。可以分别获得α受体、5-ΗΤ受体、ETb受体、ETa受体量效曲线。 1.5统计方法 数据以I 土 S表示，收缩反应以不同浓度激动剂引起收缩效应相对于60mmol吨一1钾引起的收缩效应百分数表达，反应特征表述为Emax (最大收缩百分率)和PEC5tl (产生一半最大收缩时所需要受体激动剂浓度的负对数)。采用Arunlakshana和Schild(1959)描述的方法计算拮抗剂PA2值。统计分析及作图使用Prism 4.0软件。采用双因素方差分析(Two-way AN0VA)及T检验(Student’ s t test)考察显著性，当P < 0.05时被认为有显著性。 【专利附图】【附图说明】 图1为S6c，ET-1, 5-ΗΤ和NE分别在患者大网膜动脉和大鼠肠系膜动脉引起收缩的 Emax 和 PEC50 ； A:S6c, ET-1, 5-ΗΤ和NE在患者大网膜动脉引起的Emax B:A:S6c, ET-1, 5-ΗΤ和NE在患者大网膜动脉引起的pEC5。 C:S6c, ET-1，5-ΗΤ和NE在大鼠肠系膜动脉引起的Emax D:S6c, ET-1，5-ΗΤ和本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测G‑蛋白耦联受体对缩血管物质反应的方法，包括以下具体步骤：将实验动脉血管分成高血压患者大网膜动脉组、非高血压患者大网膜动脉组、SHR肠系膜动脉组和WKY大鼠肠系膜动脉组四组；分别将四组动脉切成环置于浴槽中，累加浓度法加入去甲肾上腺素测定动脉环张力的变化，作量效曲线，考察α受体介导的收缩功能；同理分别加入5‑羟色胺、蛇毒类似物、内皮素三种物质，依次考察5‑HT、ETB、ETA三受体介导的收缩功能，用双因素方差分析和T检验检验考察显著性，同样试验方法在SHR组及WKY大鼠组用特异性5‑HT2A受体拮抗剂酮色林，α1受体拮抗剂哌唑嗪和α2受体拮抗剂萝芙素考察5‑HT2A受体、α1受体、α2受体在血管收缩中的作用，作量效曲线。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李洁，林杰，王俊杰，徐雨佳，阳建军，王安发，陈碧，张永东，
申请(专利权)人：李洁，林杰，王俊杰，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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