一种光学纯R-乙偶姻的生产方法技术

一种光学纯R-乙偶姻的生产方法，包括如下步骤：将(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因(bdh)和葡萄糖脱氢酶基因(gdh)在大肠杆菌中共表达，并以此重组大肠杆菌休止细胞为生物催化剂，以丁二酮为前体转化生产光学纯R-乙偶姻。葡萄糖脱氢酶能够提供(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶所需的辅酶NADH，而(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶在NADH存在的条件下具有催化丁二酮生成光学纯R-乙偶姻的特性，R-乙偶姻的产量可达26g/L，光学纯度为99.6％。本发明专利技术的方法培养基简单，操作过程简便，产物分离方便，不需要复杂的手性拆分步骤，并且实现胞内辅酶的再生，成本低，极具工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种光学纯R-乙偶姻的生产方法
本专利技术涉及一种光学纯R-乙偶姻的生产方法，具体是将(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因(bdh)和葡萄糖脱氢酶基因(gdh)在大肠杆菌中表达，并以此重组大肠杆菌休止细胞为生物催化剂，以丁二酮和葡萄糖为底物高效生产光学纯R-乙偶姻的方法。
技术介绍
乙偶姻(acetoin)，即3-羟基-2-丁酮(3-hydroxy-2-butanone)，有两种旋光异构体(R-乙偶姻和S-乙偶姻)，天然地存在于乳品、黄油、干酪、酒类、玉米、葡萄、苹果、草莓、可可等各类食品中，国家标准GB2760-86规定其为允许添加食用的食品香料。乙偶姻应用广泛，其具有明显的奶酪香、脂香特征，主要用于奶油、乳品、咖啡、酸奶等香料的生产。此外，乙偶姻是一种重要的化学合成中间体和多功能材料，2004年美国能源部将乙偶姻列为30种优先开发利用的平台化合物之一，可广泛应用于食品、制药、化工等领域。例如，80％含量的乙偶姻俗称“醋嗡”，是酒类调香中一个极其重要的品种。含有乙偶姻和丁二酮的混合物还可以用来治疗乳腺炎。在制药工业中，光学纯乙偶姻作为具有立体结构专一的化合物可以用来合成合成具有光学活性的手性药物，从而较大程度地提高药效，减轻药物的副作用。此外，光学纯乙偶姻还可用于合成手性液晶复合材料。光学纯乙偶姻的生产方法主要分为两类：化学合成法与生物合成法。化学合成的原料来源于不可再生的化石资源——石油，原料来源受到限制，且合成过程繁琐，最后还需要通过化学法进行复杂的手性拆分，存在成本高、收率低、光学纯度低、高能耗、高污染的问题，因此难以实现低成本大规模生产。生物合成方法生产乙偶姻具有诸多优点，如产品绿色天然、反应条件温和、污染少、能耗低，是一种十分具有发展前景的环境友好合成方法，近年来受到了越来越多的关注。然而，天然微生物发酵产生的一般都是R-乙偶姻和S-乙偶姻的旋光异构体混合物，发酵产物手性拆分工艺繁琐，成本高昂。1984年，Ui等报道了利用Pseudomonassp.S-4发酵法合成单一构型R-乙偶姻【J.Ferment.Technol.,1984,62:151-156】。该法存在产物浓度低(1.72g/L)和发酵周期长(48h)的问题。中国专利申请号CN201310346916.8于2013年公开了郝健等利用一株克雷伯氏肺炎菌(Klebsiellapneumoniae)突变菌株发酵生产R-乙偶姻，最高产量为35.7g/L。然而，K.pneumoniae被世界卫生组织列为致病菌株(Riskgroup2，pathogenicmicroorganisms)，大规模工业化生产的安全性原则在很大程度上限制了其应用【Biotechnol.Adv.,2009,27:715-725；Appl.Environ.Microbiol.,2011,77:5467-5475；Bioresour.Technol.,2012,124:237-244】。鉴于此，人们尝试构建大肠杆菌基因工程菌株来合成R-乙偶姻。1998年，Ui等将K.pneumoniae编码α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶和meso-2,3-丁二醇脱氢酶的基因簇整合到大肠杆菌中，然后将meso-2,3-丁二醇脱氢酶的编码基因敲除，获得的重组大肠杆菌可以发酵葡萄糖产生17.5g/L光学纯R-乙偶姻【Lett.Appl.Microbiol.,1998,26:275-278】，但发酵法由于发酵液成分复杂，导致发酵产物分离提取困难。此外，该法还存在发酵周期长和底物转化率低的问题，限制了其产业化应用。多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)的(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶在NADH存在的条件下可以催化丁二酮还原为R-乙偶姻【Appl.Environ.Microbiol.,2011,77:4230-4233】。两株P.polymyxa(ATCC12321和ZJ-9)的bdh基因已被证明编码(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶【Appl.Environ.Microbiol.,2011,77:4230-4233；J.Basic.Microbiol.,2012,52,1-9】，但目前尚未有P.polymyxaDSM365菌株bdh基因的相关信息报道。中国专利申请号CN201010564858公开了一种使用纯酶催化还原丁二酮的方法制备光学纯R-乙偶姻，通过构建重组大肠杆菌表达P.polymyxaATCC12321菌株的(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶，然后破碎细胞，通过表达产物分离纯化获得纯化的(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶。在加入辅酶NADH的条件下，纯化的(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶可以转化丁二酮产生光学纯R-乙偶姻。纯酶催化方法具有产物分离纯化简便的优点，但需要破碎细胞和分离纯化酶，而且需要加入昂贵的辅酶NADH，工艺繁琐，成本较高。休止细胞催化是指利用完整的休止细胞作为生物催化剂进行生物转化，其本质是利用细胞内的各种酶进行催化反应，综合了发酵法和酶法催化这两种技术的优点，克服了发酵法存在的诸多缺点。至今有两篇文献报道使用休止细胞催化的方法制备光学纯R-乙偶姻。2002年，Yamada-Onodera等在大肠杆菌中表达Hansenulapolymorpha的甘油脱氢酶，然后将重组大肠杆菌休止细胞作为全细胞生物催化剂转化光学纯(R,R)-2,3-丁二醇为R-乙偶姻，产物光学纯度达到了99.9％，但是产量很低(9.68g/L)【ActaBiotechnol,2002,22:355-362】。此外，中国专利申请号CN200910013902.8；PLoSONE,2010,5:e8860等通过构建重组大肠杆菌异源表达来自于Bacillussubtilis的(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶和来自于Lactobacillusbrevis的NADH氧化酶，获得能够催化光学纯(R,R)-2,3-丁二醇成为光学纯R-乙偶姻的重组大肠杆菌生物催化剂，但产物光学纯度较低(96％)。然而，上述的休止细胞催化反应均需要使用工业难以制备的昂贵原料——光学纯(R,R)-2,3-丁二醇，难以实现大规模的商业化生产。而丁二酮价格远远低于光学纯(R,R)-2,3-丁二醇，若能利用其为前体合成光学纯R-乙偶姻，则能有效降低R-乙偶姻的生产成本，从而更具有商业化应用前景。经广泛的文献和专利检索，我们发现来源于枯草芽孢杆菌168的葡萄糖脱氢酶基因gdh，作为辅酶在文献Engineeringofcofactorregenerationenhances(2S,3S)-2,3-butanediolproductionfromdiacetyl.中已被报道[SCIENTIFICREPORTS.,2013,3:1-6]。但目前尚未有P.polymyxaDSM365菌株(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因(bdh)的相关信息报道；而将该基因与葡萄糖脱氢酶基因(gdh)在大肠杆菌中进行共表达，并以此重组菌株制备休止细胞生物催化剂实现偶联丁二酮还原和辅酶NADH再生的R-乙偶姻生产方法，国内外亦无公开文献专利报道。
技术实现思路
针对上述现有方法中存在的R-乙偶姻产量低、光学纯度低、产物提取本文档来自技高网...

【技术保护点】
(R,R)‑2,3‑丁二醇脱氢酶基因bdh，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种光学纯R-乙偶姻的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：将(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，以及葡萄糖脱氢酶基因gdh在大肠杆菌中表达，并以此重组大肠杆菌休止细胞为生物催化剂，以丁二酮为前体转化生产光学纯R-乙偶姻。2.如权利要求1所述光学纯R-乙偶姻的生产方法，其特征在于，所述以重组大肠杆菌休止细胞为生物催化剂，以丁二酮为前体转化生产光学纯R-乙偶姻的方法，包括如下步骤：(1)平板培养：将重组大肠杆菌划线到含有质量体积比为1.5～1.8％琼脂的并含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养；(2)种子培养：在无菌的条件下，用牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到10～100mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养；(3)发酵罐培养：在无菌条件下，取步骤(2)所得的菌液以体积比为1～10％的接种量接种到0.5～10L的含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养2～10小时，然后再加入终浓度为0.1～3mM的IPTG，10～37℃诱导2～20小时，得到一种培养物；其中，上述步骤(1)～(3)中所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/LNaCl，121℃条件下灭菌15分钟；(4)收集菌体：将步骤(3)培养得到的培养物5,000～8,000rpm离心5...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢能中，黄日波，李检秀，郭铃，黄艳燕，杜奇石，王青艳，李亿，
申请(专利权)人：广西科学院，
类型：发明
国别省市：广西;45