一种化学药物体外溶血性的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种化学药物体外溶血性的检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)向受试物样品中依次加入血红细胞悬液和生理盐水后混匀，同时取血红细胞悬液和生理盐水的混合物作为阴性对照，取血红细胞悬液和去离子水的混合物作为阳性对照；(2)37℃±0.5℃环境下孵育并观察。本发明专利技术的方法检测受试物的溶血性，可以使阳性对照在较短时间内观察到血细胞溶血完全，真正建立起可靠的阳性对照，而阴性对照无溶血现象或细胞凝聚现象发生，从而获得更为准确的受试物的溶血性的检测结果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于药物安全性检测评价
，具体涉及一种化学药物体外溶血性的 检测方法。
技术介绍
溶血（Hemolysis)即为红细胞破裂，血红蛋白逸出的现象，可由多种理化因素和 毒素引起。在体外，如低渗溶液、机械性强力振荡、突然低温冷冻（_20°C?-25°C )或突然 化冻、过酸或过碱，以及酒精、乙醚、皂碱、胆碱盐等均可引起溶血。在体内，溶血可为溶血性 细菌或某些蛇毒侵入、抗原-抗体反应（如输入配血不合的血液）、各种机械性损伤、红细胞 内在（膜、酶）缺陷、某些药物等引起。 溶血性是指药物制剂引起的溶血和红细胞凝聚等反应。溶血性反应包括免疫性溶 血与非免疫性溶血。免疫性溶血是药物通过免疫反应产生抗体而引起的溶血，为Π 型和 III型过敏反应；非免疫性溶血包括药物为诱发因素导致的氧化性溶血和药物制剂引起血 液稳态的改变而出现的溶血和红细胞凝聚等反应。凡是注射剂和可能引起免疫性溶血或非 免疫性溶血反应的其他药物制剂均应进行溶血性试验。目前的溶血性试验一般按照2005 年3月生效的《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》进行，并计算溶血率。 溶血率的计算方法为：将孵育3小时后的试管离心，去上清液，选择545nm的波长，以蒸馏水 为空白对照管，采用分光光度计读取各管的0D值，溶血率的计算公式如下：溶血率=(0D试 验管-0D阴性对照管）A〇D阳性对照管-0D阴性对照管）％，当溶血率大于5%时表明有 溶血发生。 然而，在实际应用的过程中发现，该指导原则中的方法有一定的局限性，比如该方 法中的阳性对照并不会使血细胞在观察时间内溶血完全，而由溶血率的计算公式可知，只 有当阳性对照管发生100%溶血时，才能客观地评价试验管是否发生溶血。因此，现有方法 的阳性对照因溶血并不完全，其在一定程度上就失去了作为阳性对照的意义，使被测受试 物的检测结果不够准确。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有的化学药物体外溶血性的检测方法中阳 性对照溶血不完全，可能会导致被测受试物的检测结果不够准确的缺陷，而提供一种新的 化学药物体外溶血性的检测方法。以本专利技术的方法检测受试物的溶血性，可以使阳性对照 在较短时间内观察到血细胞溶血完全，真正建立起可靠的阳性对照，而阴性对照无溶血现 象或细胞凝聚现象发生，从而获得更为准确的受试物的溶血性的检测结果。 本专利技术提供下述技术方案解决上述技术问题。 本专利技术提供的技术方案是：，其包括如下步 骤： (1)向受试物样品中依次加入血红细胞悬液和生理盐水后混匀，同时取血红细胞 悬液和生理盐水的混合物作为阴性对照，取血红细胞悬液和去离子水的混合物作为阳性对 眧. (2) 37°C ±0. 5°C环境下孵育并观察； 步骤（1)中，在所述的取血红细胞悬液和生理盐水的混合物作为阴性对照的操作 中，所述的血红细胞悬液与所述的生理盐水的体积比为1 : 1. 25?1. 3 ;在所述的取血红 细胞悬液和去离子水的混合物作为阳性对照的操作中，所述的血红细胞悬液与所述的去离 子水的体积比为1 : 1. 25?1. 3。 本专利技术中，在所述的取血红细胞悬液和去离子水的混合物作为阳性对照的操作 中，所述的血红细胞悬液与所述的去离子水的体积比为1 : 1.25时，缓冲体系总体积增加 12. 5%，所述的血红细胞悬液与所述的去离子水的体积比为1 : 1. 3时，缓冲体系总体积增 加15%，均在公认的±15%范围（毒理学试验体积误差范围公认为±15% )以内。 本专利技术中，所述的化学药物为本领域常规所指的需要进行溶血性检测的各类药 物，包括血管内途径给药或非血管内途径给药的化学药物。同本领域常规一样，除另有规定 夕卜，临床用于非血管内途径给药的注射剂，以各药品使用说明书规定的临床使用浓度，用生 理盐水1 : 3稀释后作为供试品溶液；用于血管内给药的注射剂以使用说明书规定的临床 使用浓度作为供试品溶液。 步骤（1)中，所述的受试物样品如本领域常规所述，如可以按照2005年3月生效 的《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原贝IJ》中提到的指导原则选取若干个体 积配合后续加入的血红细胞悬液和生理盐水使受试物形成若干个浓度梯度；同时，选取相 对应的血红细胞悬液和生理盐水的体积，使各浓度梯度的样品混合液的总体积保持一致； 另外，阴性对照和阳性对照也包括相同体积的血红细胞悬液及相应体积的生理盐水或去离 子水，以保持与样品混合液的总体积一致。较佳地，在所述的向受试物样品中依次加入血红 细胞悬液和生理盐水后混匀的操作中，所述的受试物样品包括5个体积，分别为X、2X、3X、 4X和5X，所述的生理盐水的体积依次分别为30. 25Χ、29· 25Χ、28· 25Χ、27· 25X和26. 25X，所 述的血红细胞悬液的体积均为25Χ ;在所述的取血红细胞悬液和生理盐水的混合物作为阴 性对照的操作中，所述的血红细胞悬液的体积为25Χ，所述的生理盐水的体积为31. 25Χ ;在 所述的取血红细胞悬液和去离子水的混合物作为阳性对照的操作中，所述的血红细胞悬液 的体积为25Χ，所述的去离子水的体积为31. 25Χ，所述的X可以为任意特定体积，只要其方 便进行常规的溶血性实验即可。 步骤（1)中，所述的血红细胞悬液的浓度可以是本领域常规用于溶血性检测的血 红细胞悬液的浓度，较佳地为2%，所述的百分比为血液占血红细胞悬液的体积百分比。同 本领域常规一样，所述的2%的血红细胞悬液可以通过如下方法制备：取兔血（或羊血）数 毫升，放入含玻璃珠的三角烧瓶中振摇10分钟，或用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白原，使 成脱纤血液 ；加入0.9%氯化钠溶液约10倍量，摇匀，1000-1500171^11离心15分钟，除去 上清液，沉淀的红细胞再用0. 9%氯化钠溶液按上述方法洗涤2-3次，至上清液不显红色为 止；将所得红细胞用〇. 9 %氯化钠溶液配成2 %的混悬液，供试验用。在本专利技术中，所述的血 红细胞悬液较佳地为取自兔的血红细胞悬液。 步骤（1)中，所述的生理盐水如本领域常规所述。在本专利技术中，即指一般的哺乳动 物类生理盐水，其为0. 9%的氯化钠水溶液，它的渗透压值和正常人的血浆、组织液都是大 致一样的，所以可以用作补液（不会降低和增加正常人体内钠离子浓度）以及其他医疗用 途，也常用作体外培养活组织、细胞。所述的生理盐水一般可以通过如下方法配制得到：称 取0. 9克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100毫升。 步骤⑵中，较佳地，所述的孵育温度为37°C。 步骤（2)中，所述的观察为在孵育过程中每隔一定时间观察受试物样品混合液、 阳性对照以及阴性对照的溶血情况。较佳地，所述观察为在孵育的第1小时每15分钟观察 1次，1小时后，每隔1小时观察1次。一般来说，孵育3小时，观察3小时即可。 所述溶血情况的判断原则依照本领域常规即可，如可以按照2005年3月生效的 《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》中提到的指导原则进行，即当阴性 对照无溶血和凝聚发生，阳性对照有溶血发生时，若受试物溶液在3小时内不发生溶血和 凝聚，则受试物可以注射使用；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种化学药物体外溶血性的检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)向受试物样品中依次加入血红细胞悬液和生理盐水后混匀，同时取血红细胞悬液和生理盐水的混合物作为阴性对照，取血红细胞悬液和去离子水的混合物作为阳性对照；(2)37℃±0.5℃环境下孵育并观察；其中，步骤(1)中，在所述的取血红细胞悬液和生理盐水的混合物作为阴性对照的操作中，所述的血红细胞悬液与所述的生理盐水的体积比为1∶1.25～1.3；在所述的取血红细胞悬液和去离子水的混合物作为阳性对照的操作中，所述的血红细胞悬液与所述的去离子水的体积比为1∶1.25～1.3。

【技术特征摘要】
1. 一种化学药物体外溶血性的检测方法，其特征在于，其包括如下步骤： (1) 向受试物样品中依次加入血红细胞悬液和生理盐水后混匀，同时取血红细胞悬液 和生理盐水的混合物作为阴性对照，取血红细胞悬液和去离子水的混合物作为阳性对照； (2) 37°C ±0. 5°C环境下孵育并观察； 其中，步骤（1)中，在所述的取血红细胞悬液和生理盐水的混合物作为阴性对照的操 作中，所述的血红细胞悬液与所述的生理盐水的体积比为1 : 1. 25?1. 3 ;在所述的取血 红细胞悬液和去离子水的混合物作为阳性对照的操作中，所述的血红细胞悬液与所述的去 离子水的体积比为1 : 1. 25?1. 3。2. 如权利要求1所述的化学药物体外溶血性的检测方法，其特征在于，步骤（1)中，在 所述的向受试物样品中依次加入血红细胞悬液和生理盐水后混匀的操作中，所述的受试物 样品包括5个体积，分别为X、2X、3X、4X和5X，所述的生理盐水的体积依次分别为30. 25X、 29. 25X、28. 25X、27. 25X和26. 25X，所述的血红细胞悬液的体积均为25X ...

【专利技术属性】
技术研发人员：李华，周国民，阮斌，黄欢夏，杨琛懋，
申请(专利权)人：上海益诺思生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31