乌头酸酶突变体、其编码基因及应用制造技术

本发明专利技术提供一种乌头酸酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。编码该突变体的基因序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术通过基因工程方法使黑曲霉中乌头酸酶编码基因突变，降低其酶活力，经计算，乌头酸酶突变体的酶活力与野生型蛋白的酶活相比，降低了73％，理论上可提高柠檬酸的产量和/或产率。

【技术实现步骤摘要】
乌头酸酶突变体、其编码基因及应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种乌头酸酶突变体、其编码基因及应 用。
技术介绍
柠檬酸，又名枸橼酸，化学名称是2-羟基丙烷-1，2, 3-三羧酸。因其具有令人愉悦 的酸味，人口爽快，无后酸味，安全无毒，已成为当前世界上生产量和消费量最大的食用有 机酸。世界上柠檬酸行业的集约化程度非常高，生产重心已转移至中国，我国柠檬酸产量和 出口量已连续多年居世界第一。2008年，我国柠檬酸产能达到10万吨，占世界总量的70% 左右，其中70-80%用于生产饮料、食品，其余用于医药、化工、环保、化妆品、纺织、印染、建 筑等各个领域。 黑曲霉（Aspergillus niger)是生产朽1檬酸最常见的菌株，已有报道称黑曲霉在 发酵生产柠檬酸过程中存在三羧酸循环的酶系，其中由柠檬酸到异柠檬酸，即柠檬酸一顺 乌头酸一异柠檬酸，两步反应均由乌头酸酶（aconitase，AC0)催化。因此阻断柠檬酸向下 的代谢是柠檬酸的积累关键，即阻断乌头酸酶的催化反应。通过基因工程方法使黑曲霉中 乌头酸酶编码基因突变，降低其酶活力，理论上可提高柠檬酸的产量和/或产率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种乌头酸酶突变体、其编码基因及应用。 为了实现本专利技术目的，本专利技术的乌头酸酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所 示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。 与野生型的乌头酸酶（野生型乌头酸酶的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID No. 3和4所示）相比，本专利技术的乌头酸酶突变体具体的氨基酸序列的改变是：M226V(第226 位甲硫氨酸变为缬氨酸），N227Y (第227位天冬酰胺变为酪氨酸），T376N (第376位苏氨酸 变为天冬酰胺），A377T (第377位丙氨酸变为苏氨酸），S529P (第529位丝氨酸变为脯氨 酸），I530M(第530位异亮氨酸变为甲硫氨酸），H580R(第580位组氨酸变为精氨酸）。 本专利技术还提供编码所述乌头酸酶突变体的基因。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。 本专利技术还提供含有编码所述乌头酸酶突变体基因的载体、。 本专利技术还提供含有编码所述乌头酸酶突变体基因、或上述载体的转基因细胞系及 工程菌。 本专利技术还提供编码所述乌头酸酶突变体的基因在提高发酵生产柠檬酸产量中的 应用。 本专利技术还提供用于PCR特异性扩增编码所述乌头酸酶突变体的基因的引物对，所 述引物对为： 正向引物：5，-GATCGAGCTCATGGGGTGACGCCAGCGA-3， 反向引物：5，-GATCGCGGCCGCCATGCATAACGAATATCA-3，。 本专利技术进一步提供所述乌头酸酶突变体的构建方法，包括以下步骤： (1)从黑曲霉（Aspergillus niger)基因组DNA中，扩增AC0的编码基因 aco ; ⑵采用易错PCR技术，以AC0的编码基因 aco为模板，扩增获得AC0突变体基因； (3)将步骤（2)所得易错PCR产物及表达质粒pET28a(+)用Sac I和Not I双酶 切后连接，连接产物转入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，涂布至含Kan的LB平板，将平板 置37°C恒温培养箱培养，即得构建得到重组AC0基因突变库； (4)含Kan的LB平板上长出菌落，挑取其中的100个单克隆，转接到含Kan的LB 液体培养基中，37°C摇床培养，待菌液0D_长至0. 8时，加入终浓度为0. 2mM的IPTG诱导， 放回37°C摇床继续培养12h后，收集菌体，超声破碎，测定AC0野生型和突变体酶活，挑选酶 活力最低的一株，并测定其基因序列（SEQ ID N0. 2)。 本专利技术通过基因工程方法使黑曲霉中乌头酸酶编码基因突变，降低其酶活力，经 计算，乌头酸酶突变体的酶活力与野生型蛋白的酶活相比，降低了 73 %，理论上可提高柠檬 酸的产量和/或产率。 【附图说明】 图1为本专利技术实施例1中野生型乌头酸酶基因的PCR扩增结果。 图2为本专利技术实施例5中乌头酸酶突变体蛋白的SDS-PAGE电泳结果；其中，1为 未诱导的菌体经超声破碎后，离心所得上清，2为乌头酸酶野生型蛋白，3为乌头酸酶突变 体蛋白。 【具体实施方式】 以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。 实施例1乌头酸酶基因的获得 以 lyg黑曲霉（Aspergillus niger)基因组DNA为PCR反应模板，按SEQ ID N0.4 的序列设计正向引物 AC0-F 为 5' -GATCGAGCTCATGGGGTGACGCCAGCGA-3'，反向引物 AC0-R 为Y -GATCGCGGCCGCCATGCATAACGAATATCA-3'。其中，斜体字母部分分别为酶切位点Sac I和Not I。PCR反应在50 μ 1总体积中进行，反应条件为在94°C变性5min后开始循环； 94°C变性50s，58°C退火lmin，72°C延伸2min，共30个循环；再于72°C延伸10min。取3μ 1 PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示。取100 μ 1 PCR产物进行琼脂糖 凝胶电泳，按照胶回收试剂盒的步骤回收目的片段。 实施例2野生型乌头酸酶基因表达载体的构建 实施例1中PCR产物经限制性内切酶Sac I和Not I双酶切消化后，与同样用Sac I和Not I内切酶消化的pET-28a(+)质粒（Novagen公司）进行连接反应，构建的载体被称 为pET-ACO,然后用连接产物pET-ACO混合物转化大肠杆菌DH5- α (购自promega公司）， 并进行序列测定提取转化菌体库的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株（Promega公司）。 实施例3易错PCR扩增黑曲霉乌头酸酶基因 利用Taq DNA聚合酶不具有3' -5'校对功能的性质，在高镁离子浓度（5-9mmol/ L)和不同浓度dNTP的浓度下（1. 5-3. 5mmol/L)，来控制随机突变的频率，向目的基因中引 入随机突变，构建突变库。实验中最优的突变率约为〇. 6 %。 易错PCR反应体系（100 μ 1): lOxPCR反应缓冲液 丨Ομ丨 dATP 2 μ? dTTP 4 μ? dCTP 4 ul dGTP 2 μ? MgCb 6 μ? 正向引物 4μ1 反向引物 4μ1 DNA模板（实施例]PCR片段） 4μ1 TaqDNA聚合酶 1 μ? ddH20 59 μ I 总体积 100 μΙ PCR反应程序为：96°C预变性4min ;94°C变性lmin，56°C退火lmin，75°C延伸 2min，共45个循环；最后75°C延伸15min。采用胶回收方法回收PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
乌头酸酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1. 乌头酸酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，或该序列经替换、 缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。2. 编码权利要求1所述突变体的基因。3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。4. 含有权利要求2或3所述基因的载体。5. 含有权利要求2或3所述基因或...

【专利技术属性】
技术研发人员：李荣杰，尚海涛，杨为华，邓远德，徐斌，杨金环，
申请(专利权)人：安徽丰原发酵技术工程研究有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34