具有含氮脂环式骨架的单链核酸分子制造技术

本发明专利技术涉及具有含氮脂环式骨架的单链核酸分子。本发明专利技术的目的在于提供一种能够容易且高效地制造、能够抑制基因表达的新的核酸分子。所述分子的特征在于，其为包含抑制靶基因表达的表达抑制序列的单链核酸分子，包含区域(X)、连接子区域(Lx)和区域(Xc)，在上述区域(X)与上述区域(Xc)之间连结有上述连接子区域(Lx)，上述区域(Xc)与上述区域(X)互补，上述区域(X)和上述区域(Xc)中的至少一者包含上述表达抑制序列，上述连接子区域(Lx)具有包含吡咯烷骨架和哌啶骨架中的至少一者的非核苷酸结构。根据该单链核酸分子，能够抑制上述靶基因的表达。

【技术实现步骤摘要】
具有含氮脂环式骨架的单链核酸分子本申请是申请号为2011800375929(国际申请号为PCT/JP2011/067292)的原申请的分案申请，该原申请的申请日为2011年7月28日，专利技术名称为“具有含氮脂环式骨架的单链核酸分子”。
本专利技术涉及抑制基因表达的单链核酸分子，更详细而言，涉及具有含氮脂环式骨架的单链核酸分子、包含该单链核酸分子的组合物及其用途。
技术介绍
作为抑制基因表达的技术，例如，已知RNA干扰(RNAi)(非专利文献1)。基于RNA干扰的基因的表达抑制通常通过例如在细胞等中投与短的双链RNA分子来实施。上述双链RNA分子通常被称为siRNA(小干扰RNA)。除此之外，还报道了一种环状的RNA分子，该RNA分子通过分子内退火而部分地形成了双链，利用该RNA分子也能够抑制基因表达(专利文献1)。但是，这些方法中，诱导基因的表达抑制的RNA分子存在以下问题。首先，在制造上述siRNA的情况下，需要以下工序：在分别合成正义链和反义链之后，最后将这些链杂交。因此，存在制造效率差的问题。另外，在细胞中投与上述siRNA时，需要以抑制了其解离为单链RNA的状态投与至细胞中，因而，其操作条件的设定也需要劳力。接着，在为环状的RNA分子的情况下，存在难以合成的问题。并且，这些RNA分子基本上由核苷酸残基构成。而且，现状是，在对上述RNA分子赋予某些功能、标记时，例如，只能对作为核苷酸残基的构成要素的碱基、糖残基或磷酸基进行修饰。因此，在利用了RNA干扰的医药品等的开发中，极其难以在维持了基因表达的抑制功能的状态下进行赋予进一步的功能、标记的改变。现有技术文献非专利文献非专利文献1：Fire等、Nature、1998Feb19；391(6669)：806-11专利文献专利文献1：美国公开公报2004-058886
技术实现思路
因此，本专利技术的目的在于提供一种能够容易且高效地制造、能够抑制基因表达的新的核酸分子。为了达到上述目的，本专利技术的核酸分子的特征在于，其为包含抑制靶基因表达的表达抑制序列的单链核酸分子，包含区域(X)、连接子区域(Lx)和区域(Xc)，在上述区域(X)与上述区域(Xc)之间连结有上述连接子区域(Lx)，上述区域(X)和上述区域(Xc)中的至少一者包含上述表达抑制序列，上述连接子区域(Lx)具有包含吡咯烷骨架和哌啶骨架中的至少一者的非核苷酸结构。本专利技术的组合物的特征在于，其为用于抑制靶基因表达的组合物，其包含上述本专利技术的单链核酸分子。本专利技术的组合物的特征在于，其为药学组合物，其包含上述本专利技术的单链核酸分子。本专利技术的表达抑制方法的特征在于，其为抑制靶基因表达的方法，其使用上述本专利技术的单链核酸分子。本专利技术的疾病的治疗方法的特征在于，其包括将上述本专利技术的单链核酸分子投与至患者的工序，上述单链核酸分子具有抑制成为上述疾病的原因的基因的表达的序列作为上述表达抑制序列。本专利技术的单链核酸分子能够进行基因的表达抑制，并且由于不是环状，因而其合成容易，另外，由于是单链，因此不存在双链的退火工序，能够高效地制造。另外，由于上述连接子区域包含上述非核苷酸残基，因而不限于例如以往那样的改变核苷酸残基，例如，还能够改变上述连接子区域中的修饰等。需要说明的是，本专利技术人首次发现了本专利技术的单链核酸分子的结构能够抑制基因表达。本专利技术的单链核酸分子的基因的表达抑制效果被推测是与基于RNA干扰同样的现象，但本专利技术中的基因表达抑制不限制和限定于RNA干扰。附图说明图1是示出本专利技术的单链核酸分子的一个例子的示意图。图2是示出本专利技术的单链核酸分子的其他例子的示意图。图3是示出本专利技术的单链核酸分子的其他例子的示意图。图4是示出本专利技术的实施例中的GAPDH基因表达量的相对值的图表。图5是示出本专利技术的实施例中的稳定性的电泳照片。图6是示出本专利技术的实施例中的GAPDH基因表达量的相对值的图表。图7是示出本专利技术的实施例中的切酶(Dicer)蛋白质对于ssRNA的反应性的电泳的结果。图8是示出本专利技术的实施例中的A549细胞的GAPDH基因表达量的相对值的图表。图9是示出本专利技术的实施例中的293细胞的GAPDH基因表达量的相对值的图表。图10是示出本专利技术的实施例中的HCT116细胞的GAPDH基因表达量的相对值的图表。图11是示出本专利技术的实施例中的HCT116细胞的GAPDH基因表达量的相对值的图表。图12是示出本专利技术的实施例中的TGF-β1基因表达量的相对值的图表。图13是示出本专利技术的实施例中的各投与组中单位重量的肺的TGF-β1基因表达量的图表。图14的(A)是示出本专利技术的实施例中的各投与组的BALF样品中的TNF-α量的图表，图14的(B)是示出本专利技术的实施例中的各投与组的BALF样品中的IFN-β量的图表。图15是示出本专利技术的实施例中的核糖核酸酶耐受性的电泳照片。图16是示出本专利技术的实施例中的S7核酸酶耐受性的电泳照片。图17是示出参考例中使用的ssRNA的图。图18是示出参考例中的GAPDH基因表达量的相对值的图表。图19是示出参考例中的TGF-β1基因表达量的相对值的图表。图20是示出参考例中的LAMA基因的表达量的相对值的图表。图21是示出参考例中的LMNA基因的表达量的相对值的图表。图22是示出参考例中使用的ssRNA的图。图23是示出参考例中的GAPDH基因表达量的相对值的图表。具体实施方式只要没有特别提及，则本说明书中使用的用语能够以该
中通常所用的含义使用。1.ssPN分子如上所述，本专利技术的单链核酸分子的特征在于，其为包含抑制靶基因表达的表达抑制序列的单链核酸分子，包含区域(X)、连接子区域(Lx)和区域(Xc)，在上述区域(X)与上述区域(Xc)之间连结有上述连接子区域(Lx)，上述区域(X)和上述区域(Xc)中的至少一者包含上述表达抑制序列，上述连接子区域(Lx)具有包含吡咯烷骨架和哌啶骨架中的至少一者的非核苷酸结构。本专利技术中，“靶基因的表达抑制”例如是指阻碍上述靶基因的表达。上述抑制的机理没有特别限制，例如，可以为下降调节或沉默。上述靶基因的表达抑制能够通过例如由上述靶基因的转录产物的生成量的减少、上述转录产物的活性的减少、由上述靶基因的翻译产物的生成量的减少或者上述翻译产物的活性的减少等来确认。上述蛋白质可以举出例如成熟蛋白或者接受加工或翻译后修饰之前的前体蛋白等。以下，将本专利技术的单链核酸分子也称为本专利技术的“ssPN分子”。本专利技术的ssPN分子例如在体内(invivo)或体外(invitro)中能够用于靶基因的表达抑制，因而也称为“靶基因的表达抑制用ssPN分子”或“靶基因的表达抑制剂”。另外，本专利技术的ssPN分子例如通过RNA干扰而能够抑制上述靶基因的表达，因而也称为“RNA干扰用ssNP分子”、“RNA干扰诱导用ssPN分子”或者“RNA干扰剂或RNA干扰诱导剂”。另外，本专利技术能够抑制例如干扰素诱导等副作用。本专利技术的ssPN分子的5’末端和3’末端未连结，还能够称为线状单链核酸分子。在本专利技术的ssPN分子中，例如，本专利技术的ssPN分子以体内或体外的方式导入到细胞内的情况下，上述表达抑制序列为显示抑制上述靶基因的表达的活性的序列。上述表达抑制序列没有特别限制，能够本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单链核酸分子，其特征在于，其为包含抑制靶基因表达的表达抑制序列的单链核酸分子，包含区域(X)、连接子区域(Lx)和区域(Xc)，在所述区域(X)与所述区域(Xc)之间连结有所述连接子区域(Lx)，所述区域(Xc)与所述区域(X)互补，所述区域(X)和所述区域(Xc)中的至少一者包含所述表达抑制序列，所述连接子区域(Lx)具有包含吡咯烷骨架和哌啶骨架中的至少一者的非核苷酸结构。

【技术特征摘要】
2010.08.03 JP 2010-174915;2010.10.13 JP 2010-230801.一种单链核酸分子，其特征在于，其为包含抑制靶基因表达的表达抑制序列的单链核酸分子，包含区域X、连接子区域Lx和区域Xc，在所述区域X与所述区域Xc之间连结有所述连接子区域Lx，所述区域Xc与所述区域X互补，所述区域X和所述区域Xc中的至少一者包含所述表达抑制序列，所述连接子区域Lx具有包含吡咯烷骨架和哌啶骨架中的至少一者的非核苷酸结构；其中，所述连接子区域Lx由下述式(I)表示，所述式中，X1和X2各自独立地为H2、O、S或NH；Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S；R3为与环A上的C-3、C-4、C-5或C-6键合的氢原子或取代基；L1为由n个原子构成的亚烷基链，此处，亚烷基碳原子上的氢原子可以被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，也可以不被取代，或者，L1为所述亚烷基链的一个以上碳原子被氧原子取代的聚醚链，其中，Y1为NH、O或S的情况下，与Y1键合的L1的原子为碳，与OR1键合的L1的原子为碳，氧原子彼此不相邻；L2为由m个原子构成的亚烷基链，此处，亚烷基碳原子上的氢原子可以被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，也可以不被取代，或者，L2为所述亚烷基链的一个以上碳原子被氧原子取代的聚醚链，其中，Y2为NH、O或S的情况下，与Y2键合的L2的原子为碳，与OR2键合的L2的原子为碳，氧原子彼此不相邻；Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基；l为1或2；m为0～30的范围的整数；n为0～30的范围的整数；环A可以是所述环A上的C-2以外的1个碳原子被氮、氧或硫取代，所述环A内可以包含碳-碳双键或碳-氮双键，所述区域Xc和所述区域X分别介由-OR1-或-OR2-与所述连接子区域Lx结合，此处，R1和R2可以存在，也可以不存在，在存在的情况下，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或所述结构(I)。2.根据权利要求1所述的单链核酸分子，其中，所述区域X的碱基数X和所述5’侧区域Xc的碱基数Xc满足下述式(3)或式(5)的条件，X>Xc···(3)X＝Xc···(5)。3.根据权利要求2所述的单链核酸分子，其中，所述区域X的碱基数X和所述5’侧区域Xc的碱基数Xc满足下述式(11)的条件，X-Xc＝1、2或3···(11)。4.根据权利要求1～3中任一项所述的单链核酸分子，其中，所述区域Xc的碱基数Xc为19碱基～30碱基。5.根据权利要求1～3中任一项所述的单链核酸分子，其中，所述式(I)中，L1为...

【专利技术属性】
技术研发人员：大木忠明，林宏刚，白水久男，滨崎智洋，伊藤彰浩，铃木宽，
申请(专利权)人：株式会社博纳克，
类型：发明
国别省市：日本;JP