曲妥珠单抗突变体IgG及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程及免疫技术领域，公开了曲妥珠单抗突变体IgG及其应用。本发明专利技术通过对曲妥珠单抗重链编码DNA进行点突变，获得8个曲妥珠单抗IgG突变体，其重链的编码DNA序列选自SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.9中的任意一条。本发明专利技术曲妥珠单抗各个突变体瞬时表达得到的蛋白纯化产率同曲妥珠单抗均很高。各突变体IgG可以在不影响IgG产率和热稳定性的前提下对曲妥珠单抗的ADCC效应有不同程度的提高，同曲妥珠单抗一样，可在制备抗癌药物中应用。

【技术实现步骤摘要】
曲妥珠单抗突变体IgG及其应用
本专利技术属于基因工程及免疫
，涉及曲妥珠单抗突变体IgG及其应用。
技术介绍
自OKT3的作为抗体药物在1986年的第一次面市，抗体药物开发在过去的25年中取得了不可思议的进步。在2010年的十种最畅销的药物中有五个(Humira，Remicade，Enbrel,Rituxan和Avastin)是抗体药物或Fc融合蛋白。Her2是EGFR家族的成员之一并被发现在25-30%的乳腺癌病人中有高表达[1]，据此Her2被认为是针对乳腺癌进行靶向治疗的重要靶点。1990年，Genentech的Fendly等从一系列鼠单抗中分离到单克隆抗体4D5，并发现这个抗体结合Her2的胞外域，抑制有Her2超表达的肿瘤细胞的生长[2]。4D5于1992年被人源化，人源化后的抗体被命名为Trastuzumab[3]，商品名为Herceptin。Herceptin于1998年被FDA批准作为和Taxol（paclitaxel）联合用药治疗Her2高表达的转移性乳腺癌的一线药物。Herceptin还被批准用于经过一轮或多轮化疗后的转移性乳腺癌。在胃肠道癌症治疗方面，Herceptin还被批准和化疗药物一起治疗胃和胃食管结合区的Her2高表达的扩散性肿瘤（http://www.herceptin.com/breast）。Herceptin的作用机理被认为包括如下几个方面：1）Herceptin可以通过加速受体的内吞作用和降解而降低细胞表面Her2的水平[4]，Herceptin还可以通过诱导p27/Cdk2复合物的形成抑制细胞周期的进展[5,6]。Herceptin的第三种作用机制为诱导抗体介导的细胞毒作用（ADCC），这一作用是通过Herceptin的Fc段和骨髓细胞表面抗体受体的FcγRIII和FcγRIIB调控的[5,7]。除此之外Herceptin还被认为有抑制肿瘤新血管形成[8]和肿瘤扩散[5]的作用。在这些作用机制中，诱导ADCC被认为在Herceptin的功效中起着重要的作用。改变氨基酸序列可以被用来提高抗体诱导ADCC的能力。人IgG受体家族包含三个成员FcγRI（CD64），FcγRII(CD32)和FcγRIII（CD16）。IgG和不同的抗体受体结合可以带来截然不同的反应。和激活性抗体受体的结合FcγRI，FcγRIIA，FcγRIIIA结合会带来激活反应，导致对目标细胞细胞毒性的发生。和抑制性抗体受体，主要为FcγRIIB，结合会带来抑制反应，抑制对目标细胞细胞毒性的发生[9]（Ravetch，Annualreviewofimmunology2001）。通过一个文库的筛选，Stavenhagen等获得了对FcγRIIIA和FcγIIA的结合能力有显著提高的Fc突变体，这些突变体包括F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L，F243L/R292P/Y300L/P396L，F243L/R292P,/Y300L。这些突变体在体外ADCC实验中显示出比野生型Fc明显提高的诱导ADCC的能力。在动物实验中这些Fc突变体显示出在低浓度下优于野生型抗体的抑制肿瘤生长的能力[10]。通过ELISA和AlphaScreen测试，Anderson等筛选了对抑制性抗体受体FcγRIIB结合力下降或对激活性抗体受体FcγRIIIA结合力上升的Fc突变体。这些变异的一部分在体外实验中显示出比野生型含野生型Fc的抗体约高出10倍的诱导ADCC的能力[11]。在另一个尝试中，Tsuji等仅仅突变了Fc上的一个位点295。细胞水平上的体外结合实验显示这个突变体Fc比野生型Fc与CD16结合能力提高了八倍，而且最高结合从80%提高到了95%。在体外实验中，包含这个Fc突变体的抗体显示出比野生型Fc抗体高出约1,000倍的诱导ADCC的能力。除此之外，包含这个突变体的抗体在浓度低于0.001μg/ml（包含野生型Fc抗体作用的通常浓度）时仍然可以诱导ADCC反应[12]。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供曲妥珠单抗突变体IgG。本专利技术的另一目的是提供该突变体IgG的应用。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：曲妥珠单抗突变体IgG，其重链的编码DNA序列选自SEQIDNO.2～SEQIDNO.9中的任意一条；氨基酸序列选自SEQIDNO.11～SEQIDNO.18中的任意一条，其轻链同Trastuzumab野生型，轻链编码DNA序列为SEQID19,蛋白质序列为SEQID20。表达曲妥珠单抗突变体IgG的重组表达质粒，含有本专利技术所述的SEQIDNO.2～SEQIDNO.9中的任意一条。曲妥珠单抗突变体IgG重链编码DNA序列，其中突变体1IgG的重链编码序列为SEQIDNO.2，突变体2IgG的重链编码序列为SEQIDNO.3，突变体3IgG的重链编码序列为SEQIDNO.4，突变体4IgG的重链编码序列为SEQIDNO.5，突变体5IgG的重链编码序列为SEQIDNO.6，突变体6IgG的重链编码序列为SEQIDNO.7，突变体7IgG的重链编码序列为SEQIDNO.8，突变体8IgG的重链编码序列为SEQIDNO.9。曲妥珠单抗突变体IgG重链氨基酸序列，突变体1IgG重链氨基酸序列为SEQIDNO.11，突变体2IgG重链氨基酸序列为SEQIDNO.12，突变体3IgG重链氨基酸序列为SEQIDNO.13，突变体4IgG重链氨基酸序列为SEQIDNO.14，突变体5IgG重链氨基酸序列为SEQIDNO.15，突变体6IgG重链氨基酸序列为SEQIDNO.16，突变体7IgG重链氨基酸序列为SEQIDNO.17，突变体8IgG重链氨基酸序列为SEQIDNO.18。所述的表达质粒优选将SEQIDNO.2～SEQIDNO.9中的任意一条DNA序列重组到真核表达载体pTGE5中所得。含有曲妥珠单抗突变体IgG编码DNA的宿主细胞。所述的宿主细胞优选含有本专利技术所述重组表达质粒的HEK293‐6E细胞。本专利技术所述的曲妥珠单抗突变体IgG在制备抗癌药物中的应用。本专利技术所述的曲妥珠单抗突变体IgG优选在制备抗乳腺癌和/或胃癌药物中的应用。本专利技术所述重组表达质粒在制备抗癌药物中的应用。本专利技术所述重组表达质粒优选在制备抗乳腺癌和/或胃癌药物中的应用。本专利技术所述的曲妥珠单抗即Trastuzumab野生型。有益效果：本专利技术通过对曲妥珠单抗重链编码DNA进行点突变，获得8个曲妥珠单抗IgG突变体。曲妥珠单抗各个突变体瞬时表达得到的蛋白纯化产率同曲妥珠单抗（即Trastuzumab野生型）均很高。在PBMC细胞调节下，突变体1、2、3、6、7、8介导的ADCC效应都比曲妥珠单抗（即Trastuzumab野生型）有所提高；在NK92/CD16A细胞调节下，8个突变体介导的ADCC效应都比曲妥珠单抗（即Trastuzumab野生型）有所提高。用圆二色谱测IgG热稳定性的结果显示突变后IgG的热稳定性并无显著下降。因此，本专利技术曲妥珠单抗（即Trastuzumab野生型）的几个突变体IgG可以在不影响IgG产率和热稳定性的前提下对曲妥珠单抗（即Trastuzumab野生型）的ADCC本文档来自技高网...

【技术保护点】
曲妥珠单抗突变体IgG，其特征在于其重链的编码DNA序列选自SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.9中的任意一条。

【技术特征摘要】
1.曲妥珠单抗突变体IgG，其特征在于其重链的编码DNA序列为SEQIDNO.7；其轻链编码DNA序列为SEQIDNO.19。2.根据权利要求1所述的曲妥珠单抗突变体IgG，其特征在于其重链的氨基酸序列为SEQIDNO.16。3.表达曲妥珠单抗突变体IgG的重组表达质粒，其特征在于含有权利要求1中所述的曲妥珠单抗突变体IgG的编码DNA序列。4.根据权利要求3所述的表达曲妥珠单抗突变体IgG的重组表达质粒，其特征在于所述的表达质粒是将权利要求1中所述的曲妥珠单抗突变体IgG的编码DNA序列重组到真核表达载体pTGE5中所得。...

【专利技术属性】
技术研发人员：张剑冰，武术，杨帅，
申请(专利权)人：南京金斯瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32