用BIS-TRIS缓冲液的蛋白纯化制造技术

本发明专利技术提供用于小规模和大规模蛋白质纯化特别是单克隆抗体的两步色谱法，其仅使用由一种母液制得的四种缓冲溶液。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术提供用于小规模和大规模蛋白质纯化特别是单克隆抗体的两步色谱法，其仅使用由一种母液制得的四种缓冲溶液。【专利说明】用BIS-TRIS缓冲液的蛋白纯化
本专利技术涉及使用四种缓冲溶液的用于小规模和大规模蛋白质纯化，尤其是单克隆抗体的两步色谱过程。专利技术背景 抗体纯化可能是生物生产最为昂贵的方面之一。单克隆抗体(mAbs)通常采用在各步骤使用特定缓冲体系的三步骤三树脂色谱方法来纯化。这种常规纯化方法包括捕获步骤，接着是离子交换步骤，并且结束于抛光步骤，并通常花费3至5个工作日(包括储存和开放阶段(open phase))。随着提高的细胞培养物效价和更大的细胞培养物体积用于生产，下游加工被视为行业瓶颈。这特别与单克隆抗体生产相关，在单克隆抗体生产中，关注点由批量体积转向下游加工能力。此外，早期的临床前期和临床阶段研究要求可以更快速制造的更大量抗体。因此，在行业中有需求减少用于抗体纯化的步骤数，并减少获得批量产品所花费的时间。专利技术概述 专利技术人已经发现了用于纯化抗体的新方法，所述方法包括有限数量的步骤，同时仍能够以优异的纯度获得纯化抗体的高产率。纯化的蛋白质由此适于医疗应用。因此，该方法可用于纯化用于临床试验的蛋白质和/或用于包含该蛋白质的药物组合物的营销。简而言之，这种方法仅包括两个色谱步骤:一个亲和色谱，和一个多峰树脂色谱(multimodal resin chromatography)。此外，已经发现,在这两个色谱步骤过程中使用的缓冲液可以由相同的母液起始制备。在其它方面，所有缓冲液可以由相同的化学物质组成，尽管各缓冲液中所述化学物质的浓度可以彼此不等。这些缓冲液有利地包含Bis Tris，例如与NaCl、乙酸和水组合。由于不需要任何缓冲液交换，该方法容易进行，并且高度适于自动化和/或用于以连续模式运行。此外，所有缓冲液可以由相同化学物质组成的事实能够极大减少制备色谱柱的时间，并减少了对人工干预的需要。本专利技术的方法进一步允许减少或取消开放阶段(即其中纯化系统开放以进行手工操作的步骤，如准备用于新缓冲液的色谱柱、稀释样品或调节其PH)，由此减少污染的风险。因此，本专利技术的方法能够快速生产批量产品并减少纯化系统的占用时间。由此适于放大试验和以工业规模纯化重组蛋白质。已经建立了两种特定方案并对三种不同的抗体实施。在第一种方案中，在第一色谱步骤结束时使用Bis Tris溶液(参见实施例3、4和5)调节获得的粗蛋白质洗脱液的pH值。已经表明，该方案是通用的，只要其提供优异和可再现的结果，不考虑被纯化的特定抗体(参见实施例6)。在第二种方案中，在第一色谱步骤结束时获得的粗蛋白质洗脱液直接通过第二色谱柱，即没有经受任何处理如PH调节、缓冲液交换或稀释(参见实施例7)。在该方案中，两个色谱步骤后可接着流过膜吸附器。第二种方案具有极为快速(对100升原材料为大约7或8小时)的优点。此外，其可以完全自动化，以连续方式运行，并且不包含任何开放阶段。本专利技术由此提供一种从溶液中纯化蛋白质的方法，该方法包括第一色谱步骤和第二色谱步骤，所述第一色谱步骤包括使平衡缓冲液流经第一色谱柱，使溶液流经第一色谱柱，使平衡缓冲液流经第一色谱柱，使清洗和卫生缓冲液流经第一色谱柱，使平衡缓冲液流经第一色谱柱，使用第一洗脱缓冲液从第一色谱柱中洗脱粗蛋白质洗脱液，和任选使用BisTris溶液调节该粗蛋白质洗脱液的pH值；所述第二色谱步骤包括使平衡缓冲液流经第二色谱柱，使粗蛋白质洗脱液流经第二色谱柱，使平衡缓冲液流经第二色谱柱，和使用第二洗脱缓冲液从第二色谱柱中回收纯化的蛋白质。本专利技术还提供一种从溶液中纯化蛋白质的方法，该方法包括第一色谱步骤和第二色谱步骤，所述第一色谱步骤包括使平衡缓冲液流经第一色谱柱，使溶液流经第一色谱柱，使平衡缓冲液流经第一色谱柱，使用第一洗脱缓冲液从第一色谱柱中洗脱粗蛋白质洗脱液，和任选使用Bis Tris溶液调节该粗蛋白质洗脱液的pH值；所述第二色谱步骤包括使平衡缓冲液流经第二色谱柱，使该粗蛋白质洗脱液流经第二色谱柱，使平衡缓冲液流经第二色谱柱，使清洗和卫生缓冲液流经第二色谱柱，使平衡缓冲液流经第二色谱柱，和使用第二洗脱缓冲液从第二色谱柱中回收纯化蛋白质。在本专利技术的一个实施方案中，该Bis Tris溶液是IM的Bis Tris溶液。在其它实施方案中，各缓冲液包含Bis Tris和/或各缓冲液包含不同浓度的相同化学物质。在另一个实施方案中，各缓冲液包含Bis Tris、乙酸、NaCl和水。在本专利技术的一个实施方案中，该第一色谱柱是蛋白质A柱，该第二色谱柱是多峰树脂色谱柱。在本专利技术的另一实施方案中，该第一色谱柱是多峰树脂色谱柱，该第二色谱柱是蛋白质A柱。在本专利技术的其它实施方案中，用于从溶液中纯化蛋白质的方法不包括任何包括使该溶液流经阴离子交换色谱(AEX)柱的色谱步骤。在本专利技术的一个实施方案中，被纯化的蛋白质是抗体。在另一个实施方案中，该抗体是单克隆抗体。 在本专利技术的一个实施方案中，该方法进一步包括在步骤(b)之后使该粗蛋白质洗脱液流经膜吸附器。在其它实施方案中，该方法进一步包括在步骤(b)之后的纳滤步骤和/或在该纳滤步骤后的超滤和渗滤步骤。在本专利技术的某些实施方案中，该第一洗脱缓冲液包含20mM Bis Tris和20mM NaCl，用乙酸调节至pH 3.5 ;该第二洗脱缓冲液包含20mM Bis Tris和20mM NaCl，用乙酸调节至pH4.5 ;该平衡缓冲液包含20mM Bis Tris和20mM NaCl,用乙酸调节至pH 7.4 ;并且该清洗和卫生缓冲液包含20mM Bis Tris和IM NaCl，用乙酸调节至pH 7.4。在本专利技术的其它实施方案中，该第一洗脱缓冲液包含20mMBis Tris和20mM NaCl，用乙酸调节至pH 4.5 ;该第二洗脱缓冲液包含20mM Bis Tris和20mM NaCl，用乙酸调节至pH 3.5 ;该平衡缓冲液包含20mMBis Tris和20mM NaCl，用乙酸调节至pH 7.4 ;并且该清洗和卫生缓冲液包含20mM Bis Tris和IM NaCl，用乙酸调节至pH 7.4。本专利技术提供包含一种试剂盒，其包含多峰树脂色谱柱和/或蛋白质A柱；和至少一种包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成的缓冲液。在某些实施方案中，该试剂盒用于使用本专利技术的方法从溶液中纯化蛋白质。本专利技术还提供一种试剂盒，其包含多峰树脂色谱柱和/或蛋白质A柱；以及用于制备至少一种包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成的缓冲液的说明书。在某些实施方案中，该试剂盒用于使用本专利技术的方法从溶液中纯化蛋白质。本专利技术进一步提供了包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成的缓冲液用于通过至少一个色谱步骤从溶液中纯化蛋白质的用途。在某些实施方案中，该色谱步骤是多峰树脂色谱步骤和/或蛋白质A色谱步骤。还提供了包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成的缓冲液用于通过本专利技术的方法从溶液中纯化蛋白质的用途。本专利技术进一步提供了用于制备平衡缓冲液的方法，包括生成具有20mM Bis Tris和20mM NaCl的最终浓度的100升溶液；用乙酸将该溶液的pH调节至7.4 ;和收本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其包括：（a）第一色谱步骤，包括：‑ 使所述溶液流经第一色谱柱；‑ 使用第一洗脱缓冲液从所述第一色谱柱中洗脱粗蛋白质洗脱液；和（b）第二色谱步骤，包括：‑ 使在步骤（a）结束时获得的所述粗蛋白质洗脱液流经第二色谱柱；‑ 使用第二洗脱缓冲液从所述第二色谱柱中回收纯化的蛋白质，其中各所述缓冲液包含Bis Tris。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：D迪瑟，L朗德里比尔丹，B莫特斯，
申请(专利权)人：赛诺菲，
类型：发明
国别省市：法国;FR