腹水型抗体的纯化方法技术

一种腹水型抗体的纯化方法，包括如下步骤：在4℃将小鼠腹水离心，取清液；在清液中加入磷酸盐缓冲液进行稀释，再搅拌加入饱和的硫酸铵溶液，直至饱和度达到45%~50%，静置析晶后，经离心，得到沉淀物；在沉淀物中加入磷酸盐缓冲液溶解，得到的溶液经过0.45微米滤膜，使用葡聚糖凝胶G25脱盐柱脱盐，使用磷酸盐缓冲液进行平衡和洗脱，收集蛋白溶液；将蛋白溶液上样至Protein A/G亲和柱，再用磷酸盐缓冲液将杂蛋白从亲和柱上洗脱，然后用甘氨酸-盐酸溶液将抗体从亲和柱上洗脱，得到抗体溶液。上述腹水型抗体的纯化方法大幅度的提高了抗体的纯度，使得抗体的纯度大于90%。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】一种，包括如下步骤：在4℃将小鼠腹水离心，取清液；在清液中加入磷酸盐缓冲液进行稀释，再搅拌加入饱和的硫酸铵溶液，直至饱和度达到45%~50%，静置析晶后，经离心，得到沉淀物；在沉淀物中加入磷酸盐缓冲液溶解，得到的溶液经过0.45微米滤膜，使用葡聚糖凝胶G25脱盐柱脱盐，使用磷酸盐缓冲液进行平衡和洗脱，收集蛋白溶液；将蛋白溶液上样至Protein?A/G亲和柱，再用磷酸盐缓冲液将杂蛋白从亲和柱上洗脱，然后用甘氨酸-盐酸溶液将抗体从亲和柱上洗脱，得到抗体溶液。上述大幅度的提高了抗体的纯度，使得抗体的纯度大于90%。【专利说明】
本专利技术涉及生物化工
，特别涉及一种。
技术介绍
单克隆抗体是哺乳动物包括人类B淋巴细胞所分泌的一类能与致病原特异性结合并发生免疫应答的免疫球蛋白。单克隆抗体已广泛应用于生物学和医学研究领域。鼠源单克隆抗体的主要用途包括:1.作为研究工作中的探针或亲和层析的配体，用于生物学及医学的研究以及工业纯化；2.作为医学检验试剂或动植物病原、食物毒素或添加剂等的检测试剂，用于实验室、临床诊断试剂的开发。大量生产鼠源单抗的方法主要有两种:一是体外培养杂交瘤细胞，再从细胞上清中分离纯化抗体。二是将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔使其形成腹水。前一种方法效率很低，抗体浓度低、分离困难，成本高，但是没有鼠源性的杂质的干扰。后一种方法生产快、抗体浓度高、抗体容易纯化，但是需要使用较多小鼠，不适合大规模工业化制备，实验室最常使用。腹水的制备过程比较简单，提前一周用弗氏不完全佐剂0.5ml注射小鼠腹腔，注射佐剂后一周将生长旺盛的杂交瘤细胞注射小鼠腹腔，一般7天~10天左右就可以看到小鼠腹腔明显肿大，此时可以用注射器反复抽采腹水，直至小鼠死亡。腹水含有大量的油脂、巨噬细胞、杂交瘤细胞、腹腔内的上皮细胞、血液中的蛋白成份等杂质，需进一步纯化。抗体的各种用途往往对抗体本身的纯度要求较高。尽管抗体纯化方法较多，如传统的DEAE离子交换色谱法、盐析/沉淀法、蛋白A或蛋白G纯化、抗原亲和纯化等，但在很多情况下纯化效率均不理想，或操作复杂、成本过高不适合中小实验室使用。盐析/沉淀法主要有两种，硫酸铵沉淀法和辛酸-硫酸铵沉淀法。硫酸铵沉淀法的原理是在高浓度的盐离子条件下(一般是中性盐)，蛋白质分子在水溶液中，分子表面的水化膜被会剥夺，从而析出溶液，表现为溶解度减小而析出。通常用的盐主要是硫酸铵，在45%饱和条件下，免疫球蛋白溶解度最小而析出，同时腹水中的一些杂蛋白也会析出，因此抗体纯度不是很高。辛酸-硫酸铵两步沉淀法得到的抗体更纯，其原理是:辛酸是一种有机酸，在酸性条件下(PH4.5)，可以使大分子蛋白质沉淀，尤其是等电点(PI)值在4.5附近的白蛋白，将这些杂蛋白用辛酸沉淀完毕后，再用45%饱和硫酸铵将抗体沉淀下来即可，但是抗体的纯度也不是很高。
技术实现思路
鉴于此，有必要提供一种能够提高腹水型抗体纯度的纯化方法。一种，包括如下步骤:步骤一:在4°C将小鼠腹水离心，取清液；步骤二:在所述清液中加入磷酸盐缓冲液进行稀释，再搅拌加入饱和的硫酸铵溶液，直至饱和度达到45%~50%，静置析晶后，经离心，得到沉淀物；步骤三:在所述沉淀物中加入磷酸盐缓冲液溶解，得到的溶液经0.45微米滤膜过滤，使用葡聚糖凝胶G25脱盐柱脱盐，使用磷酸盐缓冲液进行平衡和洗脱，收集蛋白溶液；及步骤四:将所述蛋白溶液上样至ProteinA/G亲和柱上，并用磷酸盐缓冲液将杂蛋白从所述ProteinA/G亲和柱上洗脱,然后用甘氨酸_盐酸溶液将抗体从所述ProteinA/G亲和柱上洗脱，得到抗体溶液。在其中一个实施例中，步骤一中，所述小鼠腹水的离心步骤包括:先将所述腹水于1500转/分钟~2000转/分钟离心10分钟~20分钟，取清澈液体，再将所述清澈液体于10000转/分钟~12000转/分钟离心30分钟~40分钟，取上清液，即得到所述清液。在其中一个实施例中，步骤二中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH为7.0。在其中一个实施例中，在所述清液中加入磷酸盐缓冲液进行稀释时，所述清液与磷酸盐缓冲液的体积比为1:广1:2。在其中一个实施例中，步骤四中，所述甘氨酸-盐酸溶液的浓度为0.lmol/L，pH为2.7。在其中一个实施例中，步骤四之后还包括在所述抗体溶液中加入lmol/L的pH为9.0的Tris-HCl缓冲溶液进行中和。在其中一个实施例中，加入所述Tris-HCl缓冲溶液进行中和之后，还包括使用50KD超滤管离心浓缩抗体，再加入0.15mol/L的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液。上述,通过将硫酸铵沉淀法与ProteinA/G亲和柱层析相结合对腹水型抗体进行纯化，大幅度的提高了抗体的纯度，使得抗体的纯度大于90%。【专利附图】【附图说明】图1为一实施方式的流程图；图2为实施例1纯化的腹水型抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图。【具体实施方式】下面主要结合附图及具体实施例对的作进一步详细的说明。如图1所示，一实施方式的，包括如下步骤:步骤SllO:在4°C将小鼠腹水离心，取清液。其中，小鼠腹水离心的步骤包括:先将腹水于1500转/分钟~2000转/分钟离心10分钟~20分钟，取清澈液体，再将清澈液体于10000转/分钟~12000转/分钟离心30分钟~40分钟，取上清液，即得到清液。先将腹水通过低速离心去除腹水中的油脂和细胞，在通过高速离心去除腹水中的固体杂质。步骤S120:在清液中加入磷酸盐缓冲液进行稀释，再搅拌加入饱和的硫酸铵溶液，直至饱和度达到45%~50%，静置析晶后，经离心，得到沉淀物。其中，离心的条件为:在4°C下以8000转/分钟~12000转/分钟离心30分钟~40分钟。其中，静置析晶时的温度为4°C，时间为12小时以上。其中，步骤S120中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH为7.0。其中，0.02mol/L的pH为7的磷酸盐缓冲液的制备为:将1.084克的NaH2P04、3.272克的Na2HPO4.7H20和8.76克的NaCl，加水溶解定容至1L。其中，在清液中加入磷酸盐缓冲液进行稀释时，清液与磷酸盐缓冲液的体积比为1:1~1:2。步骤S130:在沉淀物中加入磷酸盐缓冲液溶解，得到的溶液经0.45微米滤膜过滤，使用葡聚糖凝胶G25 (Sephadex G25)脱盐柱脱盐，使用磷酸盐缓冲液进行平衡和洗脱，收集蛋白溶液。其中，葡聚糖凝胶G25 (Sephadex G25)脱盐柱的长度为20厘米。其中，葡聚糖凝胶 G25 (Sephadex G25)脱盐柱优选为 GE Healthcare 公司的 SephadexG25 脱盐柱。步骤S140:将蛋白溶液上样至ProteinA/G亲和柱，并用磷酸盐缓冲液将杂蛋白从ProteinA/G亲和柱上洗脱,然后用甘氨酸-盐酸溶液将抗体从ProteinA/G亲和柱上洗脱，得到抗体溶液。其中，步骤S140中，磷酸盐缓冲液平衡ProteinA/G亲和柱时，磷酸盐缓冲液的用量为亲和柱的10个以上柱体积。其中，使用的磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/L, pH为7.0。其中，ProteinA是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，ProteinG是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种腹水型抗体的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：在4℃将小鼠腹水离心，取清液；步骤二：在所述清液中加入磷酸盐缓冲液进行稀释，再搅拌加入饱和的硫酸铵溶液，直至饱和度达到45%~50%，静置析晶后，经离心，得到沉淀物；步骤三：在所述沉淀物中加入磷酸盐缓冲液溶解，得到的溶液经0.45微米滤膜过滤，使用葡聚糖凝胶G25脱盐柱脱盐，使用磷酸盐缓冲液进行平衡和洗脱，收集蛋白溶液；及步骤四：将所述蛋白溶液上样至Protein A/G亲和柱上，并用磷酸盐缓冲液将杂蛋白从所述Protein A/G亲和柱上洗脱，然后用甘氨酸‑盐酸溶液将抗体从所述Protein A/G亲和柱上洗脱，得到抗体溶液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：万晓春，王彩霞，王宏，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44