本发明专利技术提供了一种基于全血培养法处理鱼类染色体技术所用全血的方法，先将试验鱼麻醉，采血，将所得血液与ACD抗凝剂混合，得混合血液；再将所得混合血液与培养基混合，得混合液；将所得混合液叠加至Percoll分离液上，离心，去掉上层血浆，得到血浆层与分离液层交界处的淋巴细胞；然后将所得淋巴细胞加入培养基中，充分混匀，离心洗涤，得到细胞沉淀物；最后将所得细胞沉淀物转至培养基中，20～30℃培养72～96h。本发明专利技术提供的基于全血培养法制备鱼类染色体技术的全血的处理方法，能成功有效的分离出淋巴细胞，排除红细胞干扰，提高制备成功率，为保证试验结果奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞遗传学
，具体涉及一种。
技术介绍
染色体核型分析是鱼类细胞遗传学研究的重要内容之一，不仅对认识鱼类的分类系统、进化关系及染色体演化过程具有显著意义，还可为鱼类种质研究及种群鉴定提供细胞遗传学依据。目前鱼类染色体的制作方法最常用的有活体注射法和细胞培养法等。其中，PHA活体注射法，在野外没有良好设备的情况下，此法尤为适用，但这种方法要求剖杀鱼，不利于鱼种的保存，尤其是对稀有鱼类和种鱼不太合适。鱼类外周血中的淋巴细胞在一定PHA浓度的刺激下，可迅速分裂增殖，适合进行染色体的研究。利用微量的外周血进行体外培养来制备染色体可有效解决上述问题，不同鱼类，制片过程、观察方法都不尽相同。细胞培养法由于鱼类的种属特性、制片季节、PHA质量及操作者的经验等方面的差异，得到的中期分裂相的数量和质量极不稳定。为了降低试验成本，染色体的制备通常使用国产PHA，因未经纯化，具有不同程度的红细胞凝结性，尤其是某些鱼种，血液中红细胞含量丰富，对PHA的促凝效果很敏感，极易造成培养样本的凝集，导致培养失败；此外，染色体制备常用的抗凝剂肝素由于其制剂的纯度高低以及其保存时间长短不等，其抗凝效果也不相同，量大可能引起溶血、抑制淋巴细胞的转化和分裂，量少会发生凝血或培养物中出现纤维蛋白形成的膜状结构，均会影响淋巴细胞转化效率甚至试验失败。因此，每种鱼类成熟的染色体制备条件需要不断摸索和反复试验才能建立，其中，全血样本的处理至关重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，该方法能成功有效的分离出淋巴细胞，排除红细胞干扰，提高制备成功率，为保证试验结果奠定基础。，包括以下步骤: 步骤1，将试验鱼麻醉，采血，将所得血液与A⑶抗凝剂混合，得混合血液； 步骤2，将步骤I所得混合血液与第一培养基混合，得混合液； 第一培养基为0.1% FCS-L-15培养基； 步骤3，将步骤2所得混合液加至体积百分数55~65的Percoll分离液上，离心，去掉上层血浆，得到血浆层与分离液层交界处的淋巴细胞；步骤4，将步骤3所得淋巴细胞加入第二培养基中，充分混匀，离心洗涤，得到细胞沉淀物； 二培养基为0.1% FCS-L-15培养基； 步骤5，将步骤4所得细胞沉淀物转至第三培养基中，20~30°C培养72~96h ； 第三培养基为L-15培养基。作为上述专利技术的进一步改进，所述步骤2中混合血液与培养基的容积比为1:1~1:2。作为上述专利技术的进一步改进，所述步骤3中混合液与Percoll分离液的容积比为1:1 ~3:1。作为上述专利技术的进一步改进，所述步骤3中离心条件为350g、18~25°C离心15~30mino作为上述专利技术的进一步改进，所述步骤4中淋巴细胞与第二培养基的体积比为1:4 ~1: 5。作为上述专利技术的进一步改进，所述步骤4中离心条件为4°C、140g离心10min。各步骤中的培养基可以根据本领域的相关技术知识进行常规选择，本专利技术所述的“第一、第二、第三”不构成对培养基的种类是否相同的限定，只是用于描述培养基的使用次序。影响获取大量鱼类淋巴细胞的因素很多，足量的外周血液的收集、离心力、离心时间、环境温度、个体差异、血液黏稠度、鱼的进化程度等都会影响分离的淋巴细胞数量和纯度，但是，选择最佳质量浓度的细胞分离液是影响淋巴细胞有效分离的关键因素。本专利技术中所使用的Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒，不能穿透生物膜，对细胞无毒害；渗透压低(< 20mo sm/kg H20)、粘度小、可形成高达1.3g/ml的密度；此外,其扩散常数低，所形成的梯度十分稳定，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200-1000g)于几分钟至数十分钟内达到满意的分离效果。分离不同种属外周血中的淋巴细胞要求使用不同质量浓度的分离液，鱼类外周血淋巴细胞质量浓度在1.085~1.075g/ml之间，根据Percoll的浓度配置出55%~65%密度的离心液，当Percoll浓度< 55%或> 65%时，将无法收集到淋巴细胞；同时环境温度控制在18~25°C，可以保证细胞的存活率及最大的细胞分离液的分离效果；血液经过一定比例的稀释可以降低血液自身黏稠度和红细胞的聚集，提高淋巴细胞收获量。本专利技术提供的基于全血培养法制备鱼类染色体技术的全血的处理方法，能成功有效的分离出淋巴细胞，排除红细胞干扰，提高制备成功率，为保证试验结果奠定基础。【附图说明】图1为步骤2中将混合液叠加至Percoll分离液上的效果图，其中I为混合液，2为Percoll分离液； 图2为步骤2中混合液和Percoll分离液离心后的效果图，其中I为稀释的血浆，2为淋巴细胞，3为Percoll分离液，4为粒细胞，5为红细胞； 图3为实施例1所制备的黄鳝染色体的光镜图(放大400倍)； 图4为未经过全血处理所制备的黄鳝染色体的光镜图(放大400倍)； 从图3和图4的对比可以看出实施例1获得的黄鳝染色体标本红细胞干扰小、数目完整、分散良好、形态清晰； 图5为实施例2所制备的罗非鱼染色体的光镜图(放大400倍)； 图6为未经过全血处理所制备的罗非鱼染色体的光镜图(放大400倍)； 从图5和图6的对比可以看出实施例2获得的罗非鱼染色体标本红细胞干扰小、数目完整、分散良好、形态清晰。【具体实施方式】实施例1 全血培养法制备黄鳝的染色体 全血处理:MS-222麻醉后，试验鱼用酒精棉球消毒尾部体表后，超净台内，在肛门后Icm处采2mL血液，卸掉针头后，将血液转入无菌含有适量ACD抗凝剂的离心管中(注射器及A⑶提前预冷)，温和的充分混匀血液；混合后的血液与等量预冷0.1% FCS-L-15培养基稀释混匀后，缓缓加入到已盛有2mL 60%的Pereoll分离液的离心管中如图1所示，室温，水平转子，350g，离心15~30min，得到血浆层与分离液层交界处的淋巴细胞，如图2所示；将淋巴细胞置于无菌离心管中，加入4倍体积量的0.1% FCS-L-15培养基，充分混匀后，在4°C、140g离心10 min条件下洗涤2次；细胞沉淀物转至5mL L-15培养基中，轻轻摇匀后盖好盖，28 °C培养72~96 h。ACD抗凝剂配方:柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g，加水至IOOmL，灭囷后备用。0.1% FCS-L-15培养基配方:0.1mL FCS (胎牛血清)，ImL S/P (青链霉素混合液，100倍工作液)，加L-15培养基至IOOmL,备用，使用前4°C预冷。60% Percoll分离液配方:6 mL Percoll原液，ImL HBSS (10倍工作液,含伊红)，3mL无菌水混合。L-15 培养基配方:1% S/P，5% FCS 及 PHA, ρΗ:6.8 ~7.2。将经过全血处理得到的淋巴细胞经过预处理和收集、低渗和固定、滴片及染色后，即得到黄鳝染色体标本，镜检照如图3所示。从图3和图4的对比可以看出本实施例获得了红细胞干扰小、数目完整、分散良好、形态清晰的黄鳝染色体标本。实施例2 全血培养法制备罗非鱼的染色体 全血处理:MS-222麻醉后，试验鱼用酒精棉球消毒尾部体表后，超净台内，在侧线鳞处采2mL血液，卸掉针头后，本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于全血培养法处理鱼类染色体技术所用全血的方法，包括以下步骤：步骤1，将试验鱼麻醉，采血，将所得血液与ACD抗凝剂混合，得混合血液；步骤2，将步骤1所得混合血液与第一培养基混合，得混合液；第一培养基为0.1% FCS‑L‑15培养基；步骤3，将步骤2所得混合液加至体积百分数55～65的Percoll分离液上，离心，去掉上层血浆，得到血浆层与分离液层交界处的淋巴细胞；步骤4，将步骤3所得淋巴细胞加入第二培养基中，充分混匀，离心洗涤，得到细胞沉淀物；第二培养基为0.1% FCS‑L‑15培养基；步骤5，将步骤4所得细胞沉淀物转至第三培养基中，20～30℃培养72～96h；第三培养基为L‑15培养基。
【技术特征摘要】
1.基于全血培养法处理鱼类染色体技术所用全血的方法，包括以下步骤: 步骤1，将试验鱼麻醉，采血，将所得血液与A⑶抗凝剂混合，得混合血液； 步骤2，将步骤I所得混合血液与第一培养基混合，得混合液； 第一培养基为0.1% FCS-L-15培养基； 步骤3，将步骤2所得混合液加至体积百分数55~65的Percoll分离液上，离心，去掉上层血浆，得到血浆层与分离液层交界处的淋巴细胞； 步骤4，将步骤3所得淋巴细胞加入第 二培养基中，充分混匀，离心洗涤，得到细胞沉淀物； 第二培养基为0.1% FCS-L-15培养基； 步骤5，将步骤4所得细胞沉淀物转至第三培养基中，20~30°C培养72~96h ； 第三培养基为L-15培养基。2.根据权利要求1所述的基于全血培养法处理...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹丽萍，丁炜东，殷国俊，杜金梁，贾睿，刘英娟，王家豪，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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