本发明专利技术公开了一种新型的特异性细胞免疫应答体外检测方法及其临床应用，该方法包括Sm合成肽抗原的合成及筛选，待检血液与Sm混合肽抗原的混合培养，检测培养血上清液中特定细胞因子的水平。该检测方法可以应用于系统性红斑狼疮临床的辅助诊断和治疗监控。本发明专利技术具备多种临床应用功能，而且简便快速，容易操作,可灵活运用等特点，具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
新型的特异性细胞免疫应答体外检测方法及其临床应用
本专利技术属于临床免疫及医学实验诊断领域，具体涉及一种新型的细胞免疫应答体外检测技术。这种实验方法基于检测由Smith (Sm)合成肽抗原体外刺激外周血T细胞产生的细胞因子水平，为系统性红斑狼疮(SLE)的实验诊断和治疗监控提供参考。
技术介绍
系统性红斑狼疮(SLE)是影响人群最广泛、最严重的自身免疫病之一，通常好发于育龄女性，能引发全身多种组织及器官的炎症病变。由于该疾病发作潜伏，病程迁延反复并不断加重，临床表现复杂多样，诊断和治疗难度大，世界卫生组织把它列为新世纪医学领域急待攻克的堡垒。该疾病的病因目前尚不清楚。传统的观点是SLE患者的多器官炎症损害主要归因于体液免疫紊乱引起的B细胞异常活化产生的多种自身抗体，并通过抗原抗体免疫复合物沉积并激活补体等途径造成。因此，临床诊断，病情监控及治疗的参考实验指标几乎都依赖血清中自身抗体。而近年来的大量研究表明，细胞介导的免疫应答及其产生的细胞因子，特别是炎症性的细胞因子等异常可能是造成红斑狼疮病理炎症的另一关键原因(YAP，D.Y.& LAIj K.N.Cytokines and their roles in the pathogenesis of systemiclupus erythematosus: from basics to recent advances.J Biomed Biotechnolj 2010，365083.)，并与体液免疫相互作用，在整个疾病的发生和发展过程中起重要作用(DAVIS，L S.，HUTCHESON, J.& MOHAN, C.The role of cytokines in the pathogenesis andtreatment of systemic lupus erythematosus.J Interferon Cytokine Res, 2011，31，781-9.)。最近Iwata报道了一些SLE病人甚至出现以T细胞免疫紊乱为主导的发病机制(IWATA, S.，SAIT0, K., T0KUNAGA, M.& TANAKA, Y.B cell or T cell-dominantrecurrence after rituximab therapy in patients with SLE.Ann Rheum Dis.2012.)。这样，检测细胞免疫应答的产物(如细胞因子)与自身抗体一样，对SLE的诊断，监控与治疗至关重要。衡量细胞免疫应答的水平可通过检测由免疫原体外刺激全血白细胞产生的细胞因子来衡量。虽然细胞因子能敏感地反映机体的细胞免疫反应，但由于多种生理或病理因素均可影响细胞因子的释放，所以细胞因子本身不具疾病特异性(PICC0LI，L., MERONI,V.，GENC0, F.，TAMAROZZI, F.，TINELLI, C.，FILICE, C.& BRUNETTI, E.Serumcytokine profile by ELISA in patients withechinococcal cysts of the liver: astage-specific approach to assess their biological activity.Clin Dev Immunol,2012，483935.)。至今为止，国际上尚未实现以检测细胞因子来诊断自身免疫性疾病(包括SLE)的实验技术。诊断及监控SLE是基于综合临床表现及实验检查的美国风湿病学会(ACR)的分类标准，临床医生在判断该标准规定的11项指标时受主观因素影响较大，诊断准确性差，加上缺乏既敏感及特异的实验指标，经常出现误诊或漏诊。而对SLE的治疗基本上依赖各类免疫抑制剂，药物副作用大，常引发继发性感染。虽然近年来不断涌现出新型的治疗药物(细胞因子拮抗剂)，临床医生对它们的选择多依赖个人经验作主观判断，存在盲目性。而目前国际上仍缺乏能指导细胞因子个体化治疗的实验方法(KALUNIAN，K.& JOAN, T.Μ.New directions in the treatment of systemic lupus erythematosus.Curr Med ResOpin.2009.；R0NNBL0M, L & ELKONj Κ.B.Cytokines as therapeutic targets inSLE.Nat Rev Rheumatol, 2010，6，339-347.)。Smith (Sm)抗原已被证明是系统性红斑狼疮(SLE)最特异的抗原。SLE病人体内除了出现高特异的抗Sm抗体，还存在针对Sm抗原的特异性T细胞免疫反应(FRITSCH-STORK, R.，MULLEGGER, D.，SKRINER, K.，JAHN-SCHMID, B.，SM0LEN,J.S.& STEINER, G.The spliceosomal autoantigen heterogeneous nuclearribonucleoprotein A2 (hnRNP-A2) is a major T cell autoantigen in patients withsystemic lupus erythematosus.Arthritis Res Ther, 2006, 8, R118.)。与双链 DNA相比，Sm属于蛋白抗原，具有能直接刺激T细胞活化增殖并释放细胞因子的优点。基于以上背景，本专利技术结合Sm抗原对SLE的高特异性及其能在体外直接刺激T细胞活化产生大量细胞因子的高敏感性，发展了一种新型的细胞免疫应答体外检测的实验方法，用以辅助诊断SLE并为其治疗和监控提供参考。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立一种新型的细胞免疫应答体外检测方法，并用于SLE的辅助诊断和治疗监控。 本专利技术的技术方案如下: 本专利技术利用Sm抗原能特异地刺激SLE患者T细胞活化并产生多种细胞因子的现象，首先筛选出这些能被T细胞特异识别的Sm合成肽，并将其混合作为体外刺激全血细胞的抗原。基于SLE患者全血中的记忆性T细胞能快速而特异地识别Sm抗原并活化产生细胞因子，本专利技术将待检血液与Sm混合肽抗原混合培养时间控制在18-24小时(37°C )。然后检测培养血上清液中特定细胞因子的水平，以判断机体对特异性抗原的细胞免疫应答能力以及患者的整体细胞免疫功能状况。实验同时设定本底对照(只加生理盐水)及阳性对照(丝裂原:植物血凝素(PHA))。其中，用于刺激外周血的Sm混合肽抗原包含五条合成肽，由FMOC固相合成方法自动或人工合成，经HPLC分析和纯化，抗原纯度90%以上。具体氨基酸序列如下: Sml: RGNNIRYFILPDSLPLDTLLSm2:SHETVTIELKNGTQVHGTIT Sm3:GVDVSMNTHLKAVKMTSm4:TVGKSSKMLQHIDYRMRCISm5: PMGIPPGRGTPMGMPPPGM 本实验检测的结果可有多种临床用途:1.通过测定待检血经Sm混合肽刺激产生IL-6的含量，判断患者对Sm抗原的刺激是否存在高水本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新型的细胞免疫应答体外检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）筛选并混合能被T细胞特异识别的Smith(Sm)合成肽，作为刺激待检外周血白细胞的抗原，同时设立丝裂原PHA作阳性对照；（2）将待检血液与抗原混合，37℃培养20‑24小时；（3）检测培养血上清液中特定细胞因子的水平，以判断机体对特异性抗原Sm混合肽和非特异性免疫原丝裂原PHA的细胞免疫应答水平。
【技术特征摘要】
1.一种新型的细胞免疫应答体外检测方法，其特征在于包括以下步骤: (1)筛选并混合能被T细胞特异识别的Smith(Sm)合成肽，作为刺激待检外周血白细胞的抗原，同时设立丝裂原PHA作阳性对照； (2)将待检血液与抗原混合，37°C培养20-24小时； (3)检测培养血上清液中特定细胞因子的水平，以判断机体对特异性抗原Sm混合肽和非特异性免疫原丝裂原PHA的细胞免疫应答水平。2.如权利要求1所述的细胞免疫应答体外检测方法，其特征在于:所述的Sm混合肽抗原包含五条合成肽，分别为Sml、Sm2、Sm3、Sm4、Sm5 ,具体氨基酸序列如下:Sml: RGNNIRYFILPDSLPLDTLL ；Sm2:SHETVTIELKNGTQVHGTIT ；Sm3:GVDVSMNTHLKAVKMT ；Sm4:TVGKSSKMLQHIDYR...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈仁奋，魏秀妹，
申请(专利权)人：陈仁奋，
类型：发明
国别省市：福建;35
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