人乳头瘤病毒6bE7蛋白表达及应用制造技术

本发明专利技术提供人乳头瘤病毒6bE7蛋白表达纯化方法，通过设计HPV-6bE7的扩增引物，并从HPV-6b型全病毒质粒中有效扩增出该基因，插入到载体pGEX-4T2和pEGFP-C1中，获得重组载体，转染，收集上清与4B磁珠结合，再用凝血酶切除GST标签，获取HPV-6bE7蛋白，行多点免疫，获得纯化的多克隆抗体。本发明专利技术增加了该蛋白原核表达时的可溶性，从而降低下游大规模生产成本以及分离纯化难度，在提高表达量的同时也有利于分离纯化，使该蛋白在工业化放大生产时降低难度，减少成本，并经纯化、免疫，得到高特异性、高效价比的多克隆抗体，能提高检测的准确率，为进一步研究治疗尖锐湿疣疾病奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
人乳头瘤病毒6bE7蛋白表达及应用
本专利技术属生物
，涉及病毒蛋白的诱导表达和抗体制备，具体涉及抑制人乳头瘤病毒6b型E7蛋白原核表达及在制备多克隆抗体中的应用。
技术介绍
尖锐湿疣是一种危害我国人民健康和家庭幸福的性传播疾病，由人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus, HPV)引起。HPV不仅可引起皮肤粘膜上皮的抚状增生,还与多种鳞状细胞癌的发生发展有关，亚洲地区尖锐湿疣的病原体主要为人乳头瘤病毒6b型(Human Papillomavirus type 6b, HPV~6b)和 11 型(Human Papillomavirus type 11,HPV-1I)。HPV-6bE7蛋白的表达成功可为疫苗的研制提供技术支持，也可作为感染干预性研究提供理论方法。目前临床上缺乏可靠的检测方法，HPV-6bE7蛋白抗体的专利技术可为HPV临床检测提供新的方法，同时为科学研究提供新的方法学基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供人乳头瘤病毒6bE7蛋白表达、纯化方法，通过以下步骤实现: (1)/v-份济7基因的调取及扩增:设\\HPV-6bE7的扩增引物，并从HPV-6b型全病毒质粒中有效扩增出该基因，其中用于扩增用于原核表达的///V-份济7序列的上游引物序列为SEQ ID N0.1:5，-GAATTCCGCTGCCTACACTGCTGGACAA C-3’，划线部分为 &oR I 酶切位点，下游引物序列为 SEQ ID N0.2:5，-CTCGAGCTACCTGAATCGTCCGCC ATCGTT-3’，划线部分为ZAo I酶切位点； 用于扩增用于真核表达的规序列的上游引物序列为SEQ ID N0.3:5，_GAATTCTATGCATGGAAGACATGTTACCC-3’，划线部分为&oR I酶切位点，下游引物序列为SEQ ID N0.4:5’ -GGATCCTTAGGTCTTCGGTGCGCAGAT-3’,划线部分为沒ag?H I 酶切位点； (2)///V-份济7基因原核及真核表达载体的构建:将步骤(1)中得到的这两个含不同酶切位点的/V-份济7基房序列按照先后顺序插入到载体pGEX-4T2和pEGFP-Cl中，获得用于后续实验的重组载体 pGEX-4T2-(HPV-6bE7)和 pEGFP_Cl_ (HPV_6bE7)； (3)GST-(HPV-6bE7)融合蛋白的原核表达:将步骤(2)中构建的重组载体pGEX-4T2-(HPV-6bE7)转入大肠埃希菌DH5 α，待细菌OD值介于0.6-0.8之间，加IPTG至终浓度为0.2mM,并在26-28°C的诱导温度下，诱导4_6h后收集细菌，在250-300W超声功率下，超声时间9秒，间歇时间9秒，总时长约3min以破碎细菌，收集上清； (4)GST-(HPV-6bE7)融合蛋白的纯化及HPV_6bE7蛋白的获得:通过(3)步骤获得的上清与Glutathione-Sepharose 4B磁珠(GE healthcare)结合，再用凝血酶(GEhealthcare)切除GST标签，获取HPV_6bE7蛋白，PBS透析过夜获得纯化的HPV_6bE7蛋白。 本专利技术的另一个目的是提供人乳头瘤病毒6bE7蛋白在制备多克隆抗体中的应用。本专利技术获得的人类乳头瘤病毒HPV-11E7蛋白，通过免疫动物获得血清并经过纯化获得高特异性、高效价比的多克隆抗体，为进一步研究治疗尖锐湿疣奠定基础。利用本领域周知的方法可以完成同源重组载体的构建，在引物的两端引入酶切位点，通过酶切产生粘性末端，可克隆到所需载体。所用标准的分子克隆过程见(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2008.)。大肠埃希菌DH5 α购于大连宝生物TaKaRa公司，pGEX_4T2原核表达载体购于GEhealthcare, HPV_6b型全基因质粒购于美国模式培养物集存库(American type culturecollection, ATCC)，293T细胞购于中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。转化重组质粒至宿主细菌中可用通常的方法，如电穿孔、制备感受态细胞等。成功转化的细胞可通过人们熟知的技术加以鉴定，如细菌经收集并裂解，提取质粒，然后PCR鉴定、酶切鉴定或测序鉴定。体外获得HPV_6bE7蛋白，是通过基因工程手段先在大肠埃希菌中进行原核表达GST-HPV-6bE7融合蛋白，经过纯化，并切除GST标签蛋白，最终得到HPV_6bE7蛋白。该蛋白在尖锐湿疣发病机制研究中极具前景，是HPV诊断试剂开发和疫苗研发的基础。病毒蛋白一般具有不同程度的毒性，原核表达极容易形成不溶性的包涵体， 申请人:前期在大量的实验条件下，摸索可溶性蛋白的表达方式。后采用引入GST标签，并降低IPTG浓度，降低诱导时的温度，缩短诱导时间等措施。增加了该蛋白原核表达时的可溶性，从而降低下游大规模生产成 本以及分离纯化难度，在提高表达量的同时也有利于分离纯化，使该蛋白在工业化放大生产时降低难度，减少成本。为进一步研究治疗尖锐湿疣奠定基础。HPV 6b型是引起尖锐湿疣的主要原因之一，目前的检测手段很有限，如PCR，容易造成假阳性，或假阴性。HPV-6b抗体的专利技术可通过免疫组化，免疫荧光，酶联免疫吸附反应等技术来检测HPV 6b型病毒的感染，并且可与PCR技术联用，来检测HPV 6b型的感染，能大大提高检测的准确率。【附图说明】图1为重组质粒pGEX-4T2-(HPV-6bE7)的电泳示意图。图中泳道Ml:TaKaRa DL15，000 DNA marker ;泳道1: HPV_6bE7基因(用PCR法从HPV_6b型全基因质粒中扩增得到);泳道 2:重组 pMD-18T-HPV-6bE7 质粒；泳道 3:重组 pMD-18T-HPV_6bE7 经 AcoR I 和Xho I酶切；泳道4: pGEX-4T2质粒；泳道5: pGEX_4T2质粒经I和沿ο I酶切；泳道 6:重组 pGEX-4T2-HPV-6bE7 ;泳道 7:重组 pGEX-4T2-HPV_6bE7 经FcoR I 和 ZAo I 酶切；泳道 M2:TaKaRa DL 2,000 DNA marker。图2为重组质粒pEGFP-Cl-(HPV_6bE7)的电泳示意图。图中泳道Ml:TaKaRa DL15，000 DNA marker ;泳道1: HPV_6bE7基因(用PCR法从HPV_6b型全基因质粒中扩增得至丨J);泳道 2:重组 pMD-18T-HPV-6bE7 质粒；泳道 3:重组 pMD-18T-HPV_6bE7 经&oR I和I酶切；泳道4: pEGFP-Cl质粒；泳道5: pEGFP-Cl质粒经&oR I和I酶切；泳道 6:重组 pEGFP-Cl-(HPV-6bE7);泳道 7:重组 pEGFP-Cl-(HPV_6bE7)经&oR I和 I 酶切；泳道 M2 =TaKaRa DL 2, 000 DNA marker。(图3为重组蛋白GST-HPV-6bE7诱导表达、纯化、酶切的PAGE分析。图中泳道M:蛋白预染marker ;泳道1:含pGEX_4T2本文档来自技高网...

【技术保护点】
人乳头瘤病毒6bE7蛋白表达纯化方法，通过以下步骤实现：（1）HPV‑6bE7基因的调取及扩增：设计HPV‑6bE7的扩增引物，并从HPV‑6b型全病毒质粒中有效扩增出该基因，其中用于扩增用于原核表达的HPV‑6bE7序列的上游引物序列为SEQ ID NO.1：5’‑GAATTCCGCTGCCTACACTGCTGGACAA C‑3’，划线部分为EcoRⅠ酶切位点，下游引物序列为SEQ ID NO.2：5’‑CTCGAGCTACCTGAATCGTCCGCC ATCGTT‑3’，划线部分为XhoⅠ酶切位点；用于扩增用于真核表达的HPV‑6bE7序列的上游引物序列为SEQ ID NO.3：5’‑GAATTCTATGCATGGAAGACATGTTACCC‑3’，划线部分为EcoRⅠ酶切位点，下游引物序列为SEQ ID NO.4：5’‑GGATCCTTAGGTCTTCGGTGCGCAGAT‑3’，划线部分为BamHⅠ酶切位点；（2）HPV‑6bE7基因原核及真核表达载体的构建：将步骤（1）中得到的这两个含不同酶切位点的HPV‑6bE7基因序列插入到载体pGEX‑4T2和pEGFP‑C1中，获得用于后续实验的重组载体pGEX‑4T2‑(HPV‑6bE7)和pEGFP‑C1‑(HPV‑6bE7)；（3）GST‑(HPV‑6bE7)融合蛋白的原核表达：将步骤（2）中构建的重组载体pGEX‑4T2‑(HPV‑6bE7)转入大肠埃希菌DH5α，待细菌OD值介于0.6‑0.8之间，加IPTG至终浓度为0.2mM，并在26‑28℃的诱导温度下，诱导4‑6h后收集细菌，在250‑300W超声功率下，超声时间9秒，间歇时间9秒，总时长约3min以破碎细菌，收集上清；（4）GST‑(HPV‑6bE7)融合蛋白的纯化及HPV‑6bE7蛋白的获得：通过（3）步骤获得的上清与Glutathione‑Sepharose 4B磁珠（GE healthcare）结合，再用凝血酶（GE healthcare）切除GST标签，获取HPV‑6bE7蛋白，PBS透析过夜获得纯化的HPV‑6bE7蛋白。...

【技术特征摘要】
1.人乳头瘤病毒6bE7蛋白表达纯化方法，通过以下步骤实现: (1)/v-份济7基因的调取及扩增:设\\HPV-6bE7的扩增引物，并从HPV-6b型全病毒质粒中有效扩增出该基因，其中用于扩增用于原核表达的///V-份济7序列的上游引物序列为SEQ ID N0.1:5，-GAATTCCGCTGCCTACACTGCTGGACAA C-3’，划线部分为 &oR I 酶切位点，下游引物序列为 SEQ ID N0.2:5，-CTCGAGCTACCTGAATCGTCCGCC ATCGTT-3’，划线部分为ZAo I酶切位点； 用于扩增用于真核表达的规序列的上游引物序列为SEQ ID N0.3:5，_GAATTCTATGCATGGAAGACATGTTACCC-3’，划线部分为&oR I酶切位点，下游引物序列为SEQ ID N0.4:5’ -GGATCCTTAGGTCTTCGGTGCGCAGAT-3’，划线部分为沒ag?H I 酶切位点； (2)///V-份济7基因原核及真核表达载体的构建:将步骤(1)中得到的这两个含不同酶切位点的/V-份济7基房序列插入到载体pGEX-4T2和pEGFP-Cl中，获得用于后续实验的重组载体 PGEX-4T2-(HPV-6bE7)和 pEGFP-Cl-(HPV_6bE7)； (3)GST-(HPV-6bE7)融合蛋白的原核表达:将步骤(2)中构建的重组载体pGEX-4T2-(HPV-6bE7)转入大肠埃希菌D...

【专利技术属性】
技术研发人员：程浩，周强，汤怡，朱可建，陈贤祯，韩睿，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33