本发明专利技术涉及一种转基因抗虫水稻对寄生性天敌稻虱缨小蜂安全性评价方法，有3个部分，Tier-1毒性测定试验：评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对非靶标生物稻虱缨小蜂的潜在毒性；连续世代三级营养试验：通过水稻—褐飞虱—稻虱缨小蜂的食物链评价转Bt基因抗虫水稻通过寄主介导对稻虱缨小蜂的安全性影响；蛋白传递规律：通过ELISA检测手段鉴定稻虱缨小蜂暴露于转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的途径和程度；最终，根据3方面数据综合评价所述转基因作物的种植对该非靶标生物产生的生态后果。本发明专利技术建立了一套系统、科学的评价方法，对完善转基因作物对非靶标生物的影响研究以及确定转基因作物种植的生态安全性具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种，有3个部分，Tier-1毒性测定试验：评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对非靶标生物稻虱缨小蜂的潜在毒性；连续世代三级营养试验：通过水稻—褐飞虱—稻虱缨小蜂的食物链评价转Bt基因抗虫水稻通过寄主介导对稻虱缨小蜂的安全性影响；蛋白传递规律：通过ELISA检测手段鉴定稻虱缨小蜂暴露于转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的途径和程度；最终，根据3方面数据综合评价所述转基因作物的种植对该非靶标生物产生的生态后果。本专利技术建立了一套系统、科学的评价方法，对完善转基因作物对非靶标生物的影响研究以及确定转基因作物种植的生态安全性具有重要意义。【专利说明】
本专利技术属于转基因作物生态风险评价
，具体涉及一种。
技术介绍
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界有30多亿人口以稻米为食。同时水稻又是虫害最多的粮食作物之一，每年由于稻纵卷叶螟、钻蛀性螟虫等鳞翅目昆虫的为害，造成重大的产量损失(Cheng，1996 ;Nathan，2006)。在生产实际中，鳞翅目害虫的防治长期依赖于化学农药，化学农药的滥用不但增加了水稻的生产成本，而且污染环境，还容易使害虫产生抗性，降低农药的药效(Su et al，2003)。因此，高抗鳞翅目的抗性品种是一种经济、有效、环保的防治手段。然而，在水稻及野生稻中，难以找到高抗鳞翅目昆虫的抗源。要培育高抗鳞翅目害虫的水稻品种，需借助于外源抗虫基因。Bacillus thuringiensis (Bt)杀虫蛋白被用作生物源杀虫剂已经有五十多年的历史，对鳞翅目害虫有稳定的防治效果。目前转Bt基因抗虫水稻是控制鳞翅目害虫的主要抗虫水稻。然而，抗虫转基因植物的利用给人类带来利益的同时，也存在一定潜在的生态风险。转基因抗虫植物的生态安全性评价集中在:对靶标害虫的抗性治理、对非靶标生物和生物多样性的影响、基因漂移问题和对土壤微生物的影响等。转基因抗虫植物对非靶标生物的潜在影响是有关转基因作物环境风险评价的重要部分。目前，国际上的风险评价工作者以及转基因植物相关管理部门广泛采用“分层次评价体系”开展转基因植物对非靶标生物影响方面的研究工作(Romeis et al., 2008 ;王圆圆等,2011)。该评价体系就是选择合适的受试生物，然后依次开展从实验室试验到半田间试验，再到田间试验分层次分阶段进行的系统评价。褐飞風Nilaparvata lugens (SuU)是温带和热带水稻田间最主要的害虫之一，是转Bt基因水稻种植过程中重要的非靶标植食性昆虫。稻虱缨小蜂是稻飞虱主要的卵寄生性天敌，能明显降低稻飞虱的种群数量(Lou et al.，2013)，在稻田中，卵寄生蜂有可能通过半翅目昆虫的蜜露，花粉，花蜜或者其它植物液体暴露于Bt蛋白，有存在生态风险的可能性，研究转基因水稻对稻虱缨小蜂的影响是转基因作物环境安全性评价的一个重要部分，那么，建立一套系统评价转Bt基因抗虫水稻对稻虱缨小蜂是否安全的方法尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述现状，旨在提供一种安全有效、操作简便、成本低廉的。本专利技术目的的实现方式为，，包括如下3个部分:(I)Tier-1毒性测定试验:评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对非靶标生物稻虱缨小蜂的潜在毒性；①对试验批次转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白进行生物活性测定以印度谷螟作为试验昆虫，将转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白加入印度谷螟人工饲料中配制不同浓度梯度的饲料，饲料配好后，ELISA法检测不同浓度梯度该Bt蛋白的真实含量，并以纯饲料作为对照，在每份饲料中接入40头印度谷螟初孵幼虫，重复5次，7天后记录幼虫存活情况，计算LC5tl,以此判断转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的活性；②高剂量转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对稻虱缨小蜂存活率与生殖力的影响，评价稻虱缨小蜂对该Bt蛋白的敏感性；用10%蜂蜜水作为稻虱缨小蜂食物，配制三种蜂蜜水用于试验，即:纯10%蜂蜜水(w/v)作为阴性对照、含有10倍含量以上于转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的10%蜂蜜水、含有10 μ g/ml PA的10%蜂蜜水作为阳性对照；对稻虱缨小蜂存活率的影响:取4小时内羽化且已交配的稻虱缨小蜂雌蜂30头，每10头接入一个玻璃管中，用尼龙网封口，分别用以上三种蜂蜜水饲养，早晚各更换一次食物，每天分别于早、中、晚记录其死亡情况，考察高剂量转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对稻虱缨小蜂存活率的影响； 对稻虱缨小蜂生殖力的影响:用以上三种蜂蜜水分别饲养20头初羽化且已交配的稻虱缨小蜂雌蜂24小时，然后单头接入玻璃管中，玻璃管中含有褐飞虱产卵2~3天、15日龄稻苗；接虫后用尼龙网封口，6小时后移出寄生蜂，每天记录下一代稻虱缨小蜂羽化数量及性别，考察高剂量转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对稻虱缨小蜂生殖力的影响；③蜂蜜水中的转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白稳定性以及生物活性；对饲喂前后含有转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的蜂蜜水分别进行取样，重复3次，ELISA检测该Bt蛋白含量，同时，将饲喂前后含有转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的蜂蜜水稀释至80± 10%致死率的浓度，涂在印度谷螟人工饲料表面，通风厨风干2小时后，接入30头印度谷螟初孵幼虫，重复3次，7天后记录其死亡情况；(2)连续世代三级营养试验:通过水稻一褐飞風一稻虱缨小蜂的食物链评价转Bt基因抗虫水稻通过寄主介导对稻虱缨小蜂的安全性影响；①转Bt基因抗虫水稻对稻虱缨小蜂发育历期和寿命的影响将新羽化稻虱缨小蜂单对接入玻璃管中，并用尼龙网封口。玻璃管中分别装有15日龄已被褐飞虱产卵2~3天的不同水稻材料的稻苗。待稻虱缨小蜂寄生2小时后，移出寄生蜂，观察下一代稻虱缨小蜂的羽化情况，每2小时记录一次下一代稻虱缨小蜂羽化的时间、数量及性别，相应的水稻材料不同世代间重复以上寄生过程。每个水稻材料设40次重复；将羽化的稻虱缨小蜂成虫分雌雄于玻璃管中饲养，每管4头，用脱脂棉饲喂10%蜂蜜水(W/V)，早晚各更换一次食物，每天分别于早、中、晚记录其死亡情况；②转Bt基因抗虫水稻对稻虱缨小蜂生殖力、雌性率及存活率的影响将新羽化稻虱缨小蜂单对接入玻璃管中，处理方法同(2)①，将脱脂棉中加入10%蜂蜜水(《/V)，并将脱脂棉贴在玻璃管壁上饲喂稻虱缨小蜂，早晚饲喂一次；每天观察下一代稻虱缨小蜂羽化数量及性别，直到羽化完全；7天后，于体视镜下解剖稻茎，记录已寄生但未羽化的稻虱缨小蜂卵粒数，被寄生的卵变为红色；选择稻虱缨小蜂连续多代的发育历期、寿命、生殖力、雌性率以及存活率作为评价参数指标，并进行统计分析，评价由褐飞虱卵介导的转Bt基因抗虫水稻对稻虱缨小蜂的安全性影响；(3)蛋白传递规律:通过ELISA检测手段鉴定稻虱缨小蜂暴露于转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的途径和程度；对于不同的水稻材料，分别对15日龄水稻叶鞘，产于水稻叶鞘的褐飞虱卵粒以及以褐飞虱卵作为寄主的稻虱缨小蜂进行取样，叶鞘30±lmg，褐飞虱卵200粒以及所有世代收集的稻虱缨小蜂成虫，每个处理重复3~5次；采用ELISA技术，分别对以上样品中转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的含量进行检测，确定稻虱缨小蜂是否通过褐飞虱卵途径暴露于转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白以及本文档来自技高网...
【技术保护点】
转基因抗虫水稻对寄生性天敌稻虱缨小蜂安全性评价方法，其特征在于包括如下3个部分：(1)Tier‑1毒性测定试验：评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对非靶标生物稻虱缨小蜂的潜在毒性；①对试验批次转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白进行生物活性测定以印度谷螟作为试验昆虫，将转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白加入印度谷螟人工饲料中配制不同浓度梯度的饲料，饲料配好后，ELISA法检测不同浓度梯度该Bt蛋白的真实含量，并以纯饲料作为对照，在每份饲料中接入40头印度谷螟初孵幼虫，重复5次，7天后记录幼虫存活情况，计算LC50，以此判断转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的活性；②高剂量转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对稻虱缨小蜂存活率与生殖力的影响，评价稻虱缨小蜂对该Bt蛋白的敏感性；用10%蜂蜜水作为稻虱缨小蜂食物，配制三种蜂蜜水用于试验，即：纯10%蜂蜜水（w/v）作为阴性对照、含有10倍含量以上于转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的10%蜂蜜水、含有10μg/ml PA的10%蜂蜜水作为阳性对照；对稻虱缨小蜂存活率的影响：取4小时内羽化且已交配的稻虱缨小蜂雌蜂30头，每10头接入一个玻璃管中，用尼龙网封口，分别用以上三种蜂蜜水饲养，早晚各更换一次食物，每天分别于早、中、晚记录其死亡情况，考察高剂量转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对稻虱缨小蜂存活率的影响；对稻虱缨小蜂生殖力的影响：用以上三种蜂蜜水分别饲养20头初羽化且已交配的稻虱缨小蜂雌蜂24小时，然后单头接入玻璃管中，玻璃管中含有褐飞虱产卵2～3天、15日龄稻苗；接虫后用尼龙网封口，6小时后移出寄生蜂，每天记录下一代稻虱缨小蜂羽化数量及性别，考察高剂量转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对稻虱缨小蜂生殖力的影响；③蜂蜜水中的转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白稳定性以及生物活性；对饲喂前后含有转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的蜂蜜水分别进行取样，重复3次，ELISA检测该Bt蛋白含量，同时，将饲喂前后含有转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的蜂蜜水稀释至80±10%致死率的浓度，涂在印度谷螟人工饲料表面，通风厨风干2小时后，接入30头印度谷螟初孵幼虫，重复3次，7天后记录其死亡情况；(2)连续世代三级营养试验：通过水稻—褐飞虱—稻虱缨小蜂的食物链评价转Bt基因抗虫水稻通过寄主介导对稻虱缨小蜂的安全性影响；①转Bt基因抗虫水稻对稻虱缨小蜂发育历期和寿命的影响将新羽化稻虱缨小蜂单对接入玻璃管中，并用尼龙网封口。玻璃管中分别装有15日龄已被褐飞虱产卵2～3天的不同水稻材料的稻苗。待稻虱缨小蜂寄生2小时后，移出寄生蜂，观察下一代稻虱缨小蜂的羽化情况，每2小时记录一次下一代稻虱缨小蜂羽化的时间、数量及性别，相应的水稻材料不同世代间重复以上寄生过程。每个水稻材料设40次重复；将羽化的稻虱缨小蜂成虫分雌雄于玻璃管中饲养，每管4头，用脱脂棉饲喂10%蜂蜜水(w/v)，早晚各更换一次食物，每天分别于早、中、晚记录其死亡情况；②转Bt基因抗虫水稻对稻虱缨小蜂生殖力、雌性率及存活率的影响将新羽化稻虱缨小蜂单对接入玻璃管中，处理方法同（2）①，将脱脂棉中加入10%蜂蜜水(w/v)，并将脱脂棉贴在玻璃管壁上饲喂稻虱缨小蜂，早晚饲喂一次；每天观察下一代稻虱缨小蜂羽化数量及性别，直到羽化完全；7天后，于体视镜下解剖稻茎，记录已寄生但未羽化的稻虱缨小蜂卵粒数，被寄生的卵变为红色；选择稻虱缨小蜂连续多代的发育历期、寿命、生殖力、雌性率以及存活率作为评价参数指标，并进行统计分析，评价由褐飞虱卵介导的转Bt基因抗虫水稻对稻虱缨小蜂的安全性影响；(3)蛋白传递规律：通过ELISA检测手段鉴定稻虱缨小蜂暴露于转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的途径和程度；对于不同的水稻材料，分别对15日龄水稻叶鞘，产于水稻叶鞘的褐飞虱卵粒以及以褐飞虱卵作为寄主的稻虱缨小蜂进行取样，叶鞘30±1mg，褐飞虱卵200粒以及所有世代收集的稻虱缨小蜂成虫，每个处理重复3～5次；采用ELISA技术，分别对以上样品中转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的含量进行检测，确定稻虱缨小蜂是否通过褐飞虱卵途径暴露于转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白以及其暴露的程度。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：华红霞，韩宇，何月平，赵景，蔡万伦，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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