本发明专利技术公开了一种棉铃虫COPI β基因的cDNA及其应用，设计与合成棉铃虫COPI βsiRNA，棉铃虫取食COPI βsiRNA后，COPI β基因表达受阻，棉铃虫生长与代谢受抑制，死亡率提高，从而用于棉铃虫的生物防治。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种棉铃虫COPI?β基因的cDNA及其应用，设计与合成棉铃虫COPI?βsiRNA，棉铃虫取食COPI?βsiRNA后，COPI?β基因表达受阻，棉铃虫生长与代谢受抑制，死亡率提高，从而用于棉铃虫的生物防治。【专利说明】—种棉铃虫COPI β基因cDNA及其应用
本专利技术属于昆虫分子生物学与生理学领域，具体涉及棉铃虫衣被蛋白I (coatomerprotein I) β 亚基(COPI β ) cDNA 的克隆，棉铃虫 COPI β 基因小 RNA (siRNA)的设计，合成与对棉铃虫幼虫的饲喂。
技术介绍
棉铃虫(Helicoverpa armigera),夜蛾科昆虫的一种,是棉花蕾铃期重要钻姓性害虫，主要蛀食蕾、花、铃，也取食嫩叶。棉铃虫是一种世界性分布的害虫，国内各棉区均有分布和为害，北方棉区比南方棉区受害严重。棉铃虫为多食性害虫，除为害棉花外，还能为害小麦、玉米、高梁、大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵等作物，寄主植物多达20多科200余种。20世纪90年代左右，棉铃虫在我国连年暴发成灾，给棉花、玉米和蔬菜等作物生产带来了严重的威胁。据统计，1992年棉铃虫在我国各种作物上累计发生面积达2192万公顷，造成直接经济损失逾百亿元。目前表达有杀虫剂的转基因植物已成为世界上作物害虫治理的重要手段。2007年，全世界此类转基因植物的种植面积为4210万公顷，占所有转基因植物总数的37%。其中转有苏云芽孢杆菌(Bt)中杀虫剂基因的Bt棉全世界种植面积达1400万公顷。我国1997年开始种植转基因Bt棉，至2007年已达到380万公顷。2011年，全世界转基因抗虫棉的种植面积达到6600万公顷。但害虫基因突变可能危及转基因作物的抗虫功效，目前至少已发现9种害虫进化出不同程度的Bt抗性。研究表明，棉铃虫在大田环境中比在实验室条件下更容易产生遗传突变。中国北方转基因Bt棉田棉铃虫的大部分抗性等位基因为隐性的钙粘蛋白突变，包含通过实验室筛选鉴定的删除突变。因此，寻找新的杀虫靶标，培育新的抗虫种质，避免或延缓害虫抗性的产生 是一项非常紧迫的工作。RNA 干扰(RNA Interference, RNAi)是由双链 RNA (double stranded RNA, dsRNA)引起的同源mRNA特异性降解的现象，小RNA(siRNA和microRNA)在RNA干涉机制中发挥关键作用。RNA干涉普遍存在于植物、动物和真菌中，是真核生物中存在的一种抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，在农业害虫生物防治领域具有广阔的应用前景。1998年，Kennerdell与Carthew首次利用RNAi技术研究了黑腹果蚬frizzled与frizzled 2基因的功能。随后的众多研究也表明，在注射或进食靶标序列dsRNA后，昆虫靶标基因的表达也可被有效阻断。通过体外显微注射dsRNA可以成功敲除刺吸式口器害虫稻飞虱不同表达模式的基因。黄曲条跳甲在注射跨膜气味受体基因PsOrldsRNA后，对十字花科寄主的偏好性减弱。棉铃虫有一受棉酚诱导的P450基因GIP，当棉铃虫幼虫进食表达dsGIP的转基因烟草后，幼虫中肠组织中GIP的转录水平被显著抑制并伴随过氧化氢酶活性的上升，同时由于棉铃虫中肠内的GIP表达的下调而使幼虫生长受到抑制，对棉酚的耐受性降低。此外，通过dsRNA饲喂对白蚁内源纤维素基因与Hexamerin储存蛋白基因的干扰具有致死与致畸效应。经dsRNA饲喂后默R比亚按蚊的几丁质酶基因可被有效沉默。在水稻中表达跨膜转运蛋白基因或羧肽酶基因dsRNA可提高水稻对稻褐飞虱的抗性。目前很少有通过SiRNA沉默害虫靶标基因的报道。衣被蛋白I(coatomer protein I:C0PI)是真核细胞内一种负责跨膜运输的蛋白质，由7个亚基组成。真核细胞内部内膜系统各个部分之间的物质传递常常通过膜泡运输方式进行，如从内质网到高尔基体；高尔基体到溶酶体；细胞分泌物的外排，都要通过过渡性小泡进行转运。大多数运输小泡是在膜的特定区域以出芽的方式产生的。其表面具有一个笼子状的由蛋白质构成的衣被(coat)。这种衣被在运输小泡与靶细胞器的膜融合之前解体。衣被能选择性地将特定蛋白聚集在一起，形成运输小泡，并如同模具一样决定运输小泡的外部特征。COPI是已知的三类具有代表性的衣被蛋白之一。其负责回收、转运内质网逃逸蛋白(escapedproteins)返回内质网，使逃逸蛋白返回正常驻留的部位,这样内质网不会因为磷脂和某些蛋白质的匮乏而停止工作。COPI衣被小泡还可以介导高尔基体不同区域间的蛋白质运输。由此可见，COPI在真核生物的新陈代谢中发挥基础与关键的作用。研究表明，在人工饲料中添加衣被蛋白I β亚基(C0PI β ) dsRNA后，玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera)COPI的表达明显受抑制,幼虫生长停滞甚至死亡。其中饲喂12天后死亡率达50%时所需的COPI β dsRNA浓度为0.57ng/cm2。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是:提供一种棉铃虫(Helicoverpa armigera)衣被蛋白I(coatomer protein I) β亚基(C0PI β )的cDNA及其应用，设计与合成棉铃虫COPI β基因siRNA，棉铃虫取食siRNA后，COPI β基因表达受阻，棉铃虫生长与代谢受抑制，死亡率提高，从而用于棉铃虫的生物防治。本专利技术提供的技术方案是:一种棉铃虫COPI β基因的cDNA，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示。该序 列是专利技术人首次从棉铃虫中克隆的COPI β基因，该基因能够作为RNAi的靶标，在棉铃虫的防治中具有很大的应用价值。本专利技术还提供所述cDNA编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。一种所述cDNA的克隆方法，包括以下步骤:(I)从棉铃虫幼虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA ；(2)设计简并引物，所述简并引物正向序列如SEQ ID N0.3所示，反向序列如SEQIDN0.4所示；(3)以步骤(1)得到的cDNA为模板，用步骤⑵所述的引物进行PCR扩增；(4)纯化步骤(3)得到的PCR产物，回收目的片段，取纯化产物连接到PMD18-T载体上得到PMD18-T-C0PI，然后转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，筛选含pMD18-T_C0PI的阳性克隆；(5)将步骤(4)所得的阳性克隆进行序列测定，得到权利要求1所述的cDNA。所述棉铃虫COPI β cDNA的应用:所述的cDNA用于防治棉铃虫。从所述的cDNA序列中选取21bp (见SEQ ID NOl中第625-645位核苷酸)作为干涉靶标，合成双链siRNA，正向序列如SEQ ID N0.5所示,反向序列如SEQ ID N0.6所示。同时设计绿色突光蛋白基因(EGFP)双链siRNA作为对照，正向序列如SEQ ID N0.7所示，反向序列如SEQ IDN0.8所示。将所述siRNA配制成溶液施用于烟草表面，棉铃虫取食含有COPI β siRNA的烟草后，COPI β表达受抑制，正常的代谢与生理过程受破坏，棉铃虫死亡率提高，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种棉铃虫COPIβ基因的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：毛建军，曾凡荣，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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