一种评价消化酶在棉铃虫Bt蛋白抗性中作用的方法技术

本发明专利技术提供一种评价消化酶在棉铃虫Bt蛋白抗性中作用的方法，其是利用特异性消化酶抑制剂分别处理对Bt蛋白敏感和对Bt蛋白具有抗性的棉铃虫，然后进行生物测定，通过比较所述消化酶抑制剂对抗、感品系棉铃虫的Bt蛋白毒力的抑制效果，来评价所述消化酶抑制剂对应的消化酶在参与Bt蛋白抗性形成中的作用。本发明专利技术方法直观、简单，可操作性强，可用于初步分析不同消化酶参与棉铃虫对Bt蛋白抗性形成的作用，为研究昆虫抗性机制及抗性治理提供思路。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测
，具体地说，涉及一种评价消化酶在棉铃虫Bt蛋白抗性中作用的方法。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)属革兰氏阳性细菌，能产生多种类型的伴孢晶体蛋白，即δ-内毒素或称为杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalprotein,ICPs)，对鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物等具有特异性的杀虫活性。关于Bt毒素作用机理的假说有很多，穿孔模型是被广泛认可的一种。穿孔模型包括以下几个步骤：(i)摄入的毒素晶体在昆虫中肠特殊的碱性条件下水解，前毒素释放出来；(ii)前毒素在中肠蛋白酶的作用下水解为有活性的毒素单体分子；(iii)经过中肠上皮细胞糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的受体分子定位，毒素单体分子与中肠上皮细胞上的钙粘蛋白受体结合；(iv)在中肠特定的蛋白酶的作用下，毒素单体分子结构域Ⅰ中的α-1螺旋被剪切掉，毒素单体分子寡聚化；(v)寡聚化的毒素分子结合锚定在中肠上皮细胞的氨肽酶(aminopeptidaseN,APN)和碱性磷酸酯酶(alkalinephosphatase,ALP)，大量聚集的毒素分子导致上皮细胞穿孔,最终导致昆虫死亡。中肠蛋白酶在Bt前毒素的活化中起着重要作用，由于蛋白酶的缺失使前毒素的活化程度降低而产生的抗性是抗性品系中较普通的机制。Oppert等人发现,印度谷螟的(Plodiainterpunctella)中肠因缺少胰蛋白酶(trypsin)的活化作用而对Cry1A毒素产生了抗性；在玉米螟(Ostrinianubilalis)和烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)的抗性品系中也发现了类似的情况。刘晨曦等报道在棉铃虫的一个Cry1Ac抗性品系中，类胰蛋白酶的突变引起了棉铃虫对Cry1Ac的抗性；Rajagopal等也报道在棉铃虫的抗性品系中,一种丝氨酸蛋白酶HaSP2(serineprotease2)的缺失致使前毒素不能正常水解与活化。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种评价消化酶在棉铃虫Bt蛋白抗性中作用的方法。Bt蛋白的活化在Bt作用模型中是非常关键的一步，同时也是昆虫对Bt产生抗性的重要因素。鉴于目前尚未建立一套行之有效的、快速的评价各种消化酶参与Bt抗性的方法，本专利技术提供一种评价消化酶在棉铃虫Bt蛋白抗性中作用的方法，利用特异性消化酶抑制剂分别处理对Bt蛋白敏感和对Bt蛋白具有抗性的棉铃虫，然后进行生物测定(分析其抗性倍数和抑制效率)，通过比较所述消化酶抑制剂对抗、感品系棉铃虫的Bt蛋白毒力的抑制效果，来评价所述消化酶抑制剂对应的消化酶在参与Bt蛋白抗性形成中的作用。本专利技术所述特异性消化酶抑制剂对应于棉铃虫中肠消化酶中一种特定的消化酶，例如所述特异性消化酶抑制剂包括类胰蛋白酶的抑制剂N-tosyl-L-lysinechloromethylketone(TLCK)。具体地，本专利技术的一种评价消化酶在棉铃虫Bt蛋白抗性中作用的方法，包括以下步骤：1)配制一定浓度的特异性消化酶抑制剂溶液；2)选抗、感品系棉铃虫，将步骤1)配制的消化酶抑制剂溶液点滴在每头棉铃虫背部，然后饲喂含不同浓度Cry1Ac的饲料，饲喂一段时间后，进行生物测定，比较抗、感品系棉铃虫对Bt蛋白毒力的变化。前述的方法，选2日龄的抗、感品系棉铃虫幼虫进行点滴处理。前述的方法，步骤1)中用适当溶剂(例如，二甲基亚砜DMSO)溶解所述特异性消化酶抑制剂，配制浓度为10mg/mL的溶液，并以溶剂为对照。前述的方法，步骤2)中用微量点滴器将约1μL所述消化酶抑制剂溶液点滴在每头棉铃虫背部，然后饲喂含不同浓度Cry1Ac的饲料，饲喂7d后，进行生物测定。本专利技术方法直观、简单，可操作性强，可用于初步分析不同消化酶参与棉铃虫对Bt蛋白抗性形成的作用，为研究昆虫抗性机制及抗性治理提供思路。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1类胰蛋白酶在Cry1Ac抗性棉铃虫中的作用分析配制类胰蛋白酶(棉铃虫中肠消化酶中的一种蛋白酶)的特异性酶抑制剂TLCK，用DMSO将其溶解，配制成浓度为10mg/mL的酶抑制剂溶液，并以DMSO为对照；选Cry1Ac抗、感品系棉铃虫(即对Cry1Ac具有抗性或敏感的棉铃虫，本实施例中以LF做为敏感品系棉铃虫，LF120作为抗性品系棉铃虫)，分别准备72头2日龄棉铃虫(分3次重复)；配制含不同浓度Cry1Ac的人工饲料；用微量点滴器将准备好的约1μL酶抑制剂溶液，点滴在每头棉铃虫背部；将抑制剂处理后的幼虫转移到含Cry1Ac的人工饲料上进行生物测定；7日后对生测结果进行统计分析，分析其抗性倍数和抑制效率，通过比较抗、感品系棉铃虫对抑制剂的反应，来初步评价类胰蛋白酶在Cry1Ac抗性形成中作用。根据7日后的生物测定结果(表1)，与敏感品系LF相比，LF120品系棉铃虫对Cry1Ac产生了1601.72倍的抗性。类胰蛋白酶抑制剂对敏感品系的抑制效率是2.34倍，说明类胰蛋白酶参与了棉铃虫对Cry1Ac的活化作用。抑制剂对LF120的抑制效果是1.78倍，说明类胰蛋白酶在一定水平上参与了LF120品系对Cry1Ac抗性的形成；同时加入抑制剂后，棉铃虫对Cry1Ac的抗性倍数也从1601.72ng/cm2降为了888.62ng/cm2，说明其他的消化酶也可能参与毒素的消化过程，另外受体蛋白的变化等可能也是抗性产生的原因。表1类胰蛋白酶抑制剂对抗、感品系棉铃虫的抑制效果注：/：无处理或不分析；DMSO：溶剂为对照，生测前进行点滴处理；TLCK：生测前进行抑制剂点滴处理；抗性倍数：LF120的LC50除以LF的LC50抑制率：在同一品系中，TLCK处理的LC50除以DMSO的LC50。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本专利技术作了详尽的描述，但在本专利技术基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本专利技术精神的基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种评价消化酶在棉铃虫Bt蛋白抗性中作用的方法，其特征在于，利用特异性消化酶抑制剂分别处理对Bt蛋白敏感和对Bt蛋白具有抗性的棉铃虫，然后进行生物测定，通过比较所述消化酶抑制剂对抗、感品系棉铃虫的Bt蛋白毒力的抑制效果，来评价所述消化酶抑制剂对应的消化酶在参与Bt蛋白抗性形成中的作用。

【技术特征摘要】
1.一种评价消化酶在棉铃虫Bt蛋白抗性中作用的方法，其特征
在于，利用特异性消化酶抑制剂分别处理对Bt蛋白敏感和对Bt蛋白具
有抗性的棉铃虫，然后进行生物测定，通过比较所述消化酶抑制剂对
抗、感品系棉铃虫的Bt蛋白毒力的抑制效果，来评价所述消化酶抑制
剂对应的消化酶在参与Bt蛋白抗性形成中的作用。
2.根据权利要求1所述的方法，所述特异性消化酶抑制剂包括
TLCK。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其特征在于，
包括以下步骤：
1)配制一定浓度的特异性消化酶抑制剂溶液；
2)选抗、感品系棉铃虫，将步骤1)配制的消化酶抑制剂溶液点
滴在每头棉铃虫背部，然后饲喂含不同浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏纪珍，梁革梅，陈琳，王冰洁，张万娜，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11