一种团头鲂肌间骨总RNA提取方法技术

本发明专利技术公开了一种提取团头鲂肌间骨总RNA的方法，其步骤：1）以团头鲂为材料：取其肌间骨置于灭菌预冷的研钵中，研磨，至肌间骨研磨至粉末状后转入离心管中，加Trizol摇匀，室温放置；2）4℃，离心，取上清液，加入1/5体积的氯仿，摇晃，充分乳化为无分层的均匀白色乳液，室温放置；3）4℃，离心，取上清液用氯仿重复抽提；4）取上清液，加入等体积的异丙醇、柠檬酸钠、氯化钠混匀，-20℃静置；5）静置后，4℃，离心，弃上清液留沉淀，加DEPC水配置的乙醇，震荡，重复洗涤沉淀；6）4℃，离心，弃上清液留沉淀，自然晾干，加DEPC水溶解RNA，得总RNA溶液。过程简单，成本低，获得总RNA浓度高、纯度高、完整性好，满足进一步分子生物学研究。

【技术实现步骤摘要】
—种团头鲂肌间骨总RNA提取方法
本专利技术涉及一种鱼类骨骼总RNA的提取方法，具体来说是一种适用于团头鲂肌间骨总RNA提取的方法。本方法也适用于其它鱼类肌间骨总RNA的提取，提取的总RNA可用于进一步分子生物学的cDNA合成和基因表达研究。
技术介绍
鱼肉因为营养成分含量高，脂肪含量低，易于消化，适于一般人群食用而越来越受到人们的青睐。团头鮮(Megalobramaamblycephala)隶属于鲤形目,鲤科,舶亚科(Cidterinae),舫属(Megalobrama)。是我国特有的重要草食性经济鱼类之一，由于其食性广、成本低、生长快、成活率高、易捕捞，且具有味美、头小、含肉率高、体形好、规格适中等优点，因而被作为优良的草食性鱼类品种在全国普遍推广。团头鲂从养殖推广至今，养殖产量逐年增加，居我国淡水养殖产量的第六位，成为了国内淡水养殖的后起之秀和市场上的畅销鱼类。但是团头鲂肌间骨的存在，对团头鲂的加工与食用造成了很大的不利影响，所以研究团头鲂肌间骨发生的分子机制，进而培育无肌间骨的团头鲂具有重大意义。鱼类的肌间骨(intermuscular bone)也称肌间刺,位于肌节之间，是由肌膈结缔组织连续同源骨化而来的膜骨 。进行肌间骨基因表达研究的Northern blot、cDNA克隆、RT-PCR等，都需要以提取肌间骨总RNA为基础。肌间骨形态多样，分布于肌肉间，不易于采样；体积小，相对表面积大，采样过程中RNA易降解；附着肌肉不易除去，易导致蛋白污染等。诸多因素造成了提取团头鲂肌间骨总RNA的困难。目前，从骨组织中提取总RNA的方法并不多见。从体积小、易降解、易受肌肉蛋白污染的肌间骨中提取总RNA的方法更是尚未出现。用传统方法提取的肌间骨总RNA量少，污染高，无法支持进一步的分子实验。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一种团头鲂肌间骨总RNA的提取方法。本方法首次特异性针对团头鲂肌间骨组织总RNA提取的困难性，提供了一种实施过程简单，无需多种仪器设备，成本低，获得的总RNA浓度高、纯度高、完整性好，可以满足进一步分子生物学研究的方法。本方法所使用的试剂除Trizol外，都是用实验室常用药品配制而成；所用仪器仅有离心机与无菌操作台；所用工具为基本的分子实验工具与解剖器材。为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术措施: 一种团头鲂肌间骨总RNA提取方法，其步骤是: O以团头鲂为材料:采用200-300g团头鲂，为防止血液对肌间骨的污染，采用无菌注射器从团头鲂尾静脉抽取1.5-2.0ml血液，死亡后l_2min取其肌间骨置于灭菌预冷的研钵中，后边加液氮边研磨，至肌间骨研磨至粉末状后转入2ml离心管中，每50mg肌间骨粉末加ImlTrizol，摇匀，室温(20 — 25°C，以下相同)放置4 — 6min ；2)4°C, 12000rpm离心4 — 6min,取上清液,加入1/5体积的氯仿,剧烈摇晃15sec,充分乳化为无分层的均匀白色乳液，室温放置4 - 6min ； 3)4°C, 12000rpm离心14_16min,取上清液用氯仿重复抽提I 一 2次； 4)取上清液，加入等体积的异丙醇、200μ I柠檬酸钠(0.8mol/L)、200y I氯化钠(1.2mol/L)充分混匀，-20°C静置3 — 5小时； 5)静置过后，4°C，12000rpm离心9-llmin，弃上清液留沉淀，加DEPC水配置的75%(体积比)乙醇，温和震荡，重复洗涤沉淀I 一 3次； 6)4°C，7500rpm离心4一 6min，弃上清液留沉淀，自然晾干，加30 μ IDEPC水溶解RNA，既得总RNA溶液。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果: 从肌间骨中直接提取总RNA能更有针对性的研究肌间骨相关基因的表达情况，但特异性针对鱼类肌间骨总RNA的提取方法之前尚未出现。由于肌间骨组织中蛋白多糖含量高，用传统裂解法提取的肌间骨总RNA降解高，蛋白残留高。对于这些问题，本专利技术针对性的作出了解决，通过将肌间骨迅速与肌肉分离并置于液氮研磨中充分研磨，使得骨细胞充分暴露，后加入Trizol，其中含有的异硫氰酸胍有防止RNA酶发挥作用的功能，又能使细胞迅速破裂，抑制核酸酶的释放。重复使用氯仿抽提保证了 RNA的纯度和完整性。在使用异丙醇将RNA沉淀出来的同时，加入高浓度的盐溶液，使得蛋白多糖溶解析出，降低了蛋白残留。对所提取的RNA进行浓度检测、琼脂糖凝胶电泳、反转录PCR检验，得出该方法提取的肌间骨总RNA浓度高、纯度高、完整性好，可以满足进一步的分子生物学研究。【附图说明】图1为一种提取的团头鲂肌间骨总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测图。图2为一种团头鲂肌间骨总RNA反转录的cDNA模板对特定基因PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳检测图。图中条带I为cDNA模板对团头鲂内参β-actin基因PCR扩增结果的电泳图；条带II为cDNA模板对团头鮮Ras homo log gene family member Ab基因PCR扩增结果的电泳图；条带 III 为 cDNA 模板对团头鮮 transforming growth factor β -2-like 基因 PCR扩增结果的电泳图。【具体实施方式】实施例1: 一种团头鲂肌间骨总RNA提取方法，其步骤是: 1)取样，以团头鲂为材料:随机挑选200-300g的团头鲂样本鱼三条，为防止血液对肌间骨的污染，采用无菌注射器从团头鲂尾静脉抽取1.5-2.0ml血液，死亡后l-2min从鱼体肌肉中分离肌间骨并剔净肌肉组织，立即置于灭菌预冷的研钵中，依次在灭菌预冷的研钵中边加液氮边研磨，至研磨成粉末状。每条鱼取50mg肌间骨粉末，分别放进预先装有ImlTrizol的2ml灭菌离心管,摇匀，室温放置4或5或6min ； 2)将放置后的离心管在4°C，12000rpm离心5min后，吸取上清液转移至另外一支2ml灭菌离心管，加入上清液1/5体积的氯仿，剧烈摇晃15sec，使混合液充分乳化为无分层的均匀白色乳液，室温放置4或5或6min ； 3)将离心管在4°C，12000rpm离心14或15或16min，取上清液重复抽提I或2或3次； 4)抽提结束后再次取上清液转移至另外一支2ml离心管，加入等体积的异丙醇、200 μ 1柠檬酸钠(0.8mol/L)、200μ1氯化钠(1.2mol/L)，轻摇离心管充分混匀，_20°C静置4小时； 5)静置过后，将离心管4°C，12000rpm离心9或10或llmin，弃掉上清液留沉淀，向离心管中加DEPC水配置的75% (体积比)乙醇，温和震荡，充分洗涤； 6)将沉淀重复洗漆I或2或3次； 7)最后一次洗涤后，将离心管4°C，7500rpm离心4或5或6min，弃掉上清液留沉淀。在沉淀物自然晾干后，加30 μ 1 DEPC水溶解RNA，即得总RNA溶液； 8)取少量总RNA溶液用于浓度检测，其余_80°C保存，留待后续实验。团头鲂肌间骨总RNA的琼脂糖凝胶电泳结果如图1。团头鲂肌间骨总RNA反转录的cDNA模板对特定基因PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2。条带I为cDNA模板对团头鲂内参β-actin基因PCR扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种团头鲂肌间骨总RNA提取方法，其步骤是：1）以团头鲂为材料：取其肌间骨置于灭菌预冷的研钵中，后边加液氮边研磨，至肌间骨研磨至粉末状后转入2ml离心管中，每50mg肌间骨粉末加1mlTrizol，摇匀，室温放置4－6min；2）4℃，12000rpm离心4－6min，取上清液，加入1/5体积的氯仿，摇晃15sec，充分乳化为无分层的均匀白色乳液，室温放置4－6min；3）4℃，12000rpm离心15min，取上清液用氯仿重复抽提1－2次；4）取上清液，加入等体积的异丙醇、200μl0.?8mol/L柠檬酸钠、200μl1.?2mol/L氯化钠，充分混匀，?20℃静置3－5小时；5）静置过后，4℃，12000rpm离心10min，弃上清液留沉淀，加DEPC水配置的75%体积比乙醇，温和震荡，重复洗涤沉淀1－3次；6）4℃，7500rpm离心4－6min，弃上清液留沉淀，自然晾干，加30μlDEPC水溶解RNA，得总RNA溶液。

【技术特征摘要】
1.一种团头鲂肌间骨总RNA提取方法，其步骤是: 1)以团头鲂为材料:取其肌间骨置于灭菌预冷的研钵中，后边加液氮边研磨，至肌间骨研磨至粉末状后转入2ml离心管中，每50mg肌间骨粉末加ImlTrizol，摇匀，室温放置4 一6min ； 2)4°C, 12000rpm离心4 一 6min，取上清液，加入1/5体积的氯仿，摇晃15sec，充分乳化为无分层的均匀白色乳液，室温放置4 - 6min ； 3)4°C, 12000rpm离心15min,取上清...

【专利技术属性】
技术研发人员：高泽霞，万世明，易少奎，钟嘉，王卫民，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：