【技术实现步骤摘要】
一种碱裂解工艺的大肠杆菌HCP检测方法
[0001]本专利技术涉及生物制品检测领域,具体为一种碱裂解工艺的大肠杆菌
HCP
检测方法
。
技术介绍
[0002]残留宿主蛋白(
Host Cell Proteins
,
HCP
)是来自生产细胞系的宿主细胞的蛋白成分,
HCP
组成复杂,种类繁多,既包含细胞分泌蛋白,也包括结构蛋白,而且这些蛋白的理化性质,如等电点
、
疏水性
、
相对分子质量等具有显著差异
。HCP
的存在对于产品的安全性和功效可能产生影响,例如某些
HCP
可以引发生物制品的聚集或片段化,促进聚山梨酯的降解,产生含有降解产物的可见异物从而导致产品不稳定
、
疗效差等质量风险,此外一些
HCP
会引起病人的免疫应答或过敏性反应等安全风险,因此生物制品中
HCP
残留量被认为是产品的关键质量属性之一
。
在对工艺中
HCP
的监控和产品放行中,酶联免疫吸附试验(
ELISA
)一直被用作
HCP
检测的金标准,也是各国药典推荐的在生物制品中检测残留
HCP
的方法,该方法具有操作简便
、
快速
、
高通量等特点
。HCP ELSIA
检测的基本原理是基于
HCP
的多克隆抗体来识别 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.
一种碱裂解工艺的大肠杆菌
HCP
检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.
碱裂解工艺的大肠杆菌
HCP
的制备,
S11.
培养大肠杆菌获得菌体,
S12.
将步骤
S11
获得的菌体进行碱裂解,具体裂解过程如下,
P1
溶液:
50mM
葡萄糖,
25mM Tris
‑
Cl
,
10mM EDTA
,
pH8.0
重悬步骤
S11
获得的菌体,
P2
溶液:
0.2M NaOH
,
1%SDS
,
pH12.5
裂解
P1
溶液产物, P3
溶液:
3M
醋酸钾,
5M
醋酸沉淀
P2
溶液产物,收集
P3
溶液上清液作为碱裂解产物,
S13.
将步骤
S12
中的碱裂解产物进行超滤浓缩,制得大肠杆菌
HCP
抗原;
S2.
制备兔抗大肠杆菌
HCP
抗体,
S21.
第0天采用弗氏完全佐剂初次免疫新西兰白兔,大肠杆菌
HCP
抗原为
5mg
,
S22.
第
14/28/42/56
天采用弗氏不完全佐剂免疫新西兰白兔,大肠杆菌
HCP
抗原为
2.5mg
,
S23.
第
63
天采血离心,收集抗血清纯化,制得兔抗大肠杆菌
HCP
抗体;
S3.
抗大肠杆菌
HCP
抗体生物素标记,使用
NHS
‑
dPEG12
‑
生物素,对步骤
S2
中制备的兔抗大肠杆菌
HCP
抗体进行生物素标记,制备兔抗大肠杆菌
HCP
生物素化抗体;
S4.
大肠杆菌
HCP ELISA
检测方法建立,
S41.
包被:将步骤
S23
中纯化的兔抗大肠杆菌
HCP
抗体用
pH7.4、0.01M PBS
缓冲液,稀释成1μ
g/mL~8
μ
g/mL
进行包被,每孔加
100
μ
L
,然后用封板膜封口,置于
4℃
包被过夜,
S42.
封闭:甩干除去包被液,
300
μ
L
由1×
PBS+0.05% Tween 20
组成的洗涤液洗涤一次,每孔加入
300
μ
L
由
1%BSA+PBS
组成的封闭液,室温孵育2小时,甩干除去封闭液,过夜吹干,
S43.
...
【专利技术属性】
技术研发人员:江鹏,陈文峻,秦俭,陈旭,陈刚,
申请(专利权)人:上海吉泰依科赛生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:
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