【技术实现步骤摘要】
一种诱导猪多能性细胞的诱导剂以其构建方法与应用
[0001]本专利技术属于基因工程
,具体涉及一种诱导猪多能性细胞的诱导剂以其构建方法与应用
。
技术介绍
[0002]胚胎干细胞
(Embryonic Stem Cells
,
ESC)
作为一种发育生物学模型,可用于研究胚胎发育过程中的关键调控因子和分子机制,还可以诱导分化出具有特定功能的细胞和组织,在医药产品和再生医学的研发中可发挥重要作用
。
但与小鼠和人的
ESC
建立不同,大型哺乳动物的
ESC
很难获得和维持
。
[0003]猪是重要的家畜,鉴于它们在器官解剖
、
生理和代谢方面与人类相似,可以作为理想的医学模型
。
猪多能干细胞的产生在开发疾病模型
、
实现异种移植和改善其生产特性方面发挥着重要作用
。
然而,猪
ESC
的获得面临许多挑战,到目前为止还没有建立真正的猪
ESC。
已发表的细胞系通常不符合严格的多能性标准,被称为“ES
样”细胞
。
没有明确的培养体系,且有效性较低
。
目前,猪
ESC
的鉴定标准仍然参考于小鼠或人类胚胎干细胞的标准
。
所获得的细胞在体外培养条件下难以实现长期稳定生长,许多临床应用和猪的复杂转基因修饰无法推进
。
诱导多能干细胞< ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.
一种诱导猪多能性细胞的诱导剂,其特征在于,所述诱导剂为以
Cas12a
‑
Activ
载体作为基础载体骨架,将
OCT4、SOX2、CMYC、KLF4、CTNNB1、DNMT3L、TCL1、SALL4、NANOG、FBXO15、ERAS、DPPA2、DPPA3、GRB2、DPPA4、DPPA5、FTHL17、REX1、ECAT1、ECAT8、SOX15、STAT3、UTF1
和
GDF3
基因的
sgRNA
串联合成一个片段
S24
,然后连接到基础载体骨架中获得
Cas12a
‑
Activ
‑
24
重组载体或以
Cas12a
‑
Activ
载体作为基础载体骨架,将
OCT4、SOX2、KLF4、CMYC、NANOG、CTNNB1、ERAS、FBOX15、TCL1
和
DPPA2
基因的
sgRNA
串联合成一个片段是
S10
,然后连接到基础载体骨架中获得
Cas12a
‑
Activ
‑
10
重组载体
。2.
根据权利要求1所述的诱导剂,其特征在于,
OCT4
基因的
Gene ID
为
100127461
;
SOX2
基因的
Gene ID
为
407739
;
CMYC
基因的
Gene ID
为
448810
;
KLF4
基因的
Gene ID
为
595111、CTNNB1
基因的
Gene ID
为
397657、DNMT3L
基因的
Gene ID
为
100621554、TCL1
基因的
Gene ID
为
100156364、SALL4
基因的
Gene ID
为
100136902、NANOG
基因的
Gene ID
为
106507523、FBXO15
基因的
Gene ID
为
100516237、ERAS
基因的
Gene ID
为
100621986、DPPA2
基因的
Gene ID
为
100620381、DPPA3
基因的
Gene ID
为
100511328、GRB2
基因的
Gene ID
为
100192436、DPPA4
基因的
Gene ID
为
100620290、DPPA5
基因的
Gene ID
为
100301558、FTHL17
基因的
Gene ID
为
100154515、REX1
基因的
Gene ID
为
100627512、ECAT1
基因的
Gene ID
为
100738024、ECAT8
基因的
Gene ID
为
102162257、SOX15
基因的
Gene ID
为
100522397、STAT3
基因的
Gene ID
为
733648、UTF1
基因的
Gene ID
为
100158138
和
GDF3
基因的
Gene ID
为
100510963。3.
根据权利要求1或2所述的诱导剂在诱导猪成纤维细胞重编程为猪多能性细胞中的应用
。4.
根据权利要求1或2所述的诱导剂在激活基因的有效性中的应用
。5.
构建权利要求1所述的诱导剂的方法,其特征在于,所述的方法如下:
(1)
构建
Cas12a
‑
Activ
‑
24
重组载体的方法:
24
个基因的
sgRNA
串联片段
S24
合成后,使用
S24+HA
‑
F
和
S24+HA
‑
R
引物对
S24
基因片段进行
PCR
扩增,此
PCR
反应会对
S24
基因片段两端加上同源臂,扩增后获得
HA
‑
S24
‑
HA DNA
片段;
(2)
使用
BsmBI
限制性内切酶对
Cas12a
‑
Activ
载体骨架进行酶切,经电泳分离胶回收,制备得到
Cas12a
‑
Activ
骨架
DNA
与
HA
‑
S24
‑
HA DNA
片段后,通过同源重组的方式将
24
个基因的
sgRNA
串联片段
S24
连入
Cas12a
‑
Activ
载体获得
Cas12a
‑
Activ
‑
24
重组载体;或
1)
构建
Cas12a
‑
Activ
‑
10
重组载体的方法:
10
个基因的
sgRNA
串联片段
S10
合成后,使用
S10+HA
‑
F
和
S10+HA
‑
R
引物对
S10
基因片段进行
PCR
扩增,此
PCR
反应会对
S10
基因片段两端加上同源臂,扩增后获得
HA
‑
S10
‑
HA DNA
片段;
2)
使用
BsmBI
限制性内切酶对
Cas12a
‑
Activ
载体骨架进行酶切,经电泳分离胶回收,制备得到
Cas12a
‑
Activ
骨架
DNA
...
【专利技术属性】
技术研发人员:牟彦双,刘忠华,耿立爽,郭晓晨,李鑫禹,
申请(专利权)人:东北农业大学,
类型:发明
国别省市:
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