视网膜色素上皮细胞在替代角膜内皮方面的应用制造技术

本发明专利技术公开了视网膜色素上皮细胞在用于替代角膜内皮细胞、预防和治疗角膜内皮功能失代偿等疾病或症状方面的应用。本发明专利技术提供的视网膜色素上皮细胞悬液能够恢复角膜透明度，降低角膜厚度，重建角膜内皮屏障功能，有效治疗角膜内皮功能失代偿，对于因角膜损伤而视力受损人群的治疗或恢复具有广泛的应用价值和积极的社会效益。极的社会效益。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】视网膜色素上皮细胞在替代角膜内皮方面的应用


[0001]本专利技术属于医药领域，涉及视网膜色素上皮细胞在缓解或治疗角膜内皮功能失代偿方面的应用。

技术介绍

[0002]角膜是位于眼球前壁的一层透明膜，分为五层，由前向后依次为：上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层、内皮细胞层。角膜的高度透明性和光学性是正常发挥生理功能的必要条件之一，而角膜内皮细胞在维持角膜的正常生理功能方面起重要作用。角膜内皮细胞是角膜内层的单层细胞，构成后弹力层和房水之间的物理屏障，通过离子“泵”功能调节角膜中离子浓度和水分，维持角膜的半脱水状态，保证角膜的正常厚度和透明度。一旦角膜内皮细胞功能出现紊乱，常导致角膜水肿，引起部分甚至完全角膜盲。
[0003]正常人角膜内皮细胞在体内增殖能力极为有限。外伤、炎症、白内障手术等造成的内皮细胞损伤和丢失，只能依靠周围细胞的扩大和移行来填补。当人角膜内皮细胞密度下降到其生理临界值(约400
‑
500个/mm2)时，会出现角膜水肿，严重者视力丧失。目前全国有角膜盲患者约400万，其中内皮盲患者近100万。角膜移植是临床治疗角膜内皮功能失代偿的唯一手段。由于我国角膜供体材料缺乏，每年只有不到1万名患者通过角膜移植手术复明，远不能满足临床需求。为了解决角膜供体短缺的难题，目前主要的角膜内皮替代种子细胞研究策略包括培养的人角膜内皮细胞、皮肤祖细胞等成体干细胞以及人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells,hESCs)与人诱导多能干细胞(Human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)来源的角膜内皮样细胞。
[0004]尽管，利用原代培养的人角膜内皮细胞、成体干细胞或多能干细胞来源的角膜内皮样细胞可以改善角膜内皮功能，但是效果有限。截止目前，一直没有理想的角膜内皮替代种子细胞实现角膜长期透明且临床广泛应用。日本科学家Kinoshita教授团队通过前房注射法移植培养的人角膜内皮细胞对11名角膜内皮营养不良患者进行临床治疗并恢复角膜透明，但5年随访结果显示部分患者角膜内皮再次出现病理性“黑区”结构。培养的人角膜内皮细胞仍旧依赖于优质的供体角膜，且成人的角膜内皮种子细胞无法体外大量扩增，因此细胞的来源和数量有限；成体干细胞来源的替代细胞，比如皮肤祖细胞来源的角膜内皮样细胞，纯度差、产业化制备困难且治疗效果有限；hESC/hiPSC具有无限增殖能力和多向分化潜能，已有报道将hESC/hiPSC分化为神经嵴、角膜内皮前体和成熟角膜内皮样细胞，部分实验证明角膜内皮前体细胞与成熟角膜内皮样细胞可以应用于动物模型恢复角膜透明，但是，目前没有标准化的hESC/hiPSC向角膜内皮细胞定向分化的方法，hESC/hiPSC来源角膜内皮样细胞应用于体内治疗的长期有效性与安全性仍有待研究。因此寻找理想角膜内皮细胞替代种子细胞依旧是角膜内皮治疗领域亟需解决的难题。

技术实现思路

[0005]经过大量的研究，专利技术人发现，视网膜色素上皮细胞虽然在组织分化来源、解剖学
位置、在体组织细胞功能方面与角膜内皮细胞存在巨大的差异，但具有规则六边形样形态，表达紧密连接蛋白，提示视网膜色素上皮细胞具有代替角膜内皮细胞提供屏障功能、治疗角膜内皮功能失代偿的可能性。为了解决现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种角膜内皮替代细胞；进一步的目的为选择hESC/hiPSC来源的视网膜色素上皮细胞作为种子细胞，提供了一种可以无限供应且临床安全应用的种子细胞来源；更进一步的目的为提高移植细胞的功能，优化细胞悬液制备过程，保障移植细胞正常功能。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供一种视网膜色素上皮细胞悬液，所述细胞悬液包括视网膜色素上皮细胞和DMEM低糖培养基，其中，视网膜色素上皮细胞与DMEM低糖培养基的配比为3
×
105～1.2
×
106个：200～300微升；优选地，视网膜色素上皮细胞与DMEM低糖培养基的配比为5
×
105～1
×
106个：200～300微升。
[0007]在本专利技术一个优选实施方式中，所述视网膜色素上皮细胞由人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞分化获得。
[0008]在本专利技术一个优选实施方式中，所述人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞敲除色素生成基因Tyrosinase。
[0009]在本专利技术一个优选实施方式中，所述细胞悬液还包括一种或多种特异性抑制剂，所述特异性抑制剂包括Y27632,尼克酰胺和/或TGF
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β抑制剂SB431542。
[0010]本专利技术还提供了一种视网膜色素上皮细胞悬液的制备方法，包括以下步骤：
[0011]步骤1、诱导分化：利用分化培养基获得hESC/hiPSC来源视网膜色素上皮细胞；
[0012]步骤2、酶解处理：利用细胞消化酶处理步骤1中hESC/hiPSC来源视网膜色素上皮细胞，利用完全培养基终止酶反应；
[0013]步骤3、单细胞收集：利用移液器轻轻的吹打步骤2中的细胞成单细胞，并收集入离心管中，离心后弃上清保留细胞沉淀；
[0014]步骤4、制备细胞悬液：利用DMEM基础培养基重悬步骤3中的细胞，每200～300微升DMEM基础培养基溶解3
×
105～1.2
×
106个细胞，获得细胞悬液。
[0015]在本专利技术一个优选实施方式中，步骤1中所述分化培养基包括1:1比例的DMEM/F12与Neuralbasal medium,1
‑
4mM谷氨酰胺,0.1
‑
1.3mM非必需氨基酸，0.1
‑
1.3mMβ
‑
巯基乙醇和1％ N2添加物；
[0016]在本专利技术一个优选实施方式中，步骤1中所述分化培养基包括DMEM/F12培养基，5
‑
15％血清替代物，1
‑
4mM谷氨酰胺,0.1
‑
1.3mM非必需氨基酸，0.1
‑
1.3mMβ
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巯基乙醇；
[0017]在本专利技术一个更优选实施方式中，步骤1中所述分化培养基包括分化培养基1和分化培养基2，其中分化培养基1包括DMEM/F12与Neuralbasal medium(1:1),2mM谷氨酰胺,0.1mM非必需氨基酸，0.1mMβ
‑
巯基乙醇和1％ N2添加物；分化培养基2包括DMEM/F12培养基，10％血清替代物，2mM谷氨酰胺,0.1mM非必需氨基酸，0.1mMβ
‑
巯基乙醇。即诱导分化方法为利用混合2％ Matrigel的细胞分化培养基1(DMEM/F12与Neuralbasal medium(1:1),2mM谷氨酰胺,0.1mM非必需氨基酸，0.1mMβ
‑
巯基乙醇和1％ N2添加物)培养2天，更换无Matrigel的培养基培养5天；更换分化培养基2(DMEM/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.视网膜色素上皮细胞用于角膜内皮替代细胞的应用。2.视网膜色素上皮细胞在制备用于缓解或治疗角膜内皮损伤、角膜内皮病变、角膜内皮细胞功能紊乱、角膜内皮细胞功能失代偿的医药组合物中的应用。3.视网膜色素上皮细胞在制备用于缓解或治疗患有角膜内皮细胞功能失代偿患者角膜厚度异常、角膜透明度下降、角膜水肿、视力下降或丧失、眼睛干涩、疼痛的医药组合物中的应用。4.如权利要求2
‑
3所述的应用，其特征在于，所述视网膜色素上皮细胞施用于患者眼球前房；所述医药组合物包括视网膜色素上皮细胞和DMEM低糖培养基，其中，视网膜色素上皮细胞与DMEM低糖培养基的配比为3
×
105～1.2
×
106个：200～300微升。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述视网膜色素上皮细胞与DMEM低糖培养基的配比为5
×
105～1
×
106个：200～300微升。6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述医药组合物还包括一种或多种特异性抑制剂，所述特异性抑制剂包括Y27632,尼克酰胺和/或TGF
‑
β抑制剂SB431542。7.如权利要求2
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3任一项所述的应用，其特征在于，所述视网膜色素上皮细胞由人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞分化获得。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞敲除色素生成基因Tyrosinase。9.如权利要求2
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3任一项所述的应用，其特征在于，所述医药组合物的剂型为注射剂、细胞片或试剂盒。10.一种视网膜色素上皮细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、诱导分化：利用分化培养基获得hESC/hiPSC来源视网膜色素上皮细胞；步骤2、酶解处理：利用细胞消化酶处理步骤1中hESC/hiPSC来源视网膜色素上...

【专利技术属性】
技术研发人员：史伟云，周庆军，李宗义，董春晓，段豪云，
申请(专利权)人：山东第一医科大学附属眼科研究所山东省眼科研究所，山东第一医科大学附属青岛眼科医院，
类型：发明
国别省市：