核酸构建体和其制造方法技术

本发明专利技术涉及可以用于许多应用中的新型人工合成的单链核酸分子以及用于制备所述单链核酸分子的模板和方法。单链核酸分子有许多用途，包含但不限于用于递送序列(例如，基因序列，或用于基因编辑、基因敲入或敲低的模板)的载体或用于生物工程中，例如用于从纳米颗粒结构单元构建高度有序的材料。构单元构建高度有序的材料。构单元构建高度有序的材料。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸构建体和其制造方法


[0001]本专利技术涉及可以用于许多应用中的新型人工合成的单链核酸分子以及用于制备所述单链核酸分子的模板和方法。单链核酸分子有许多用途，包含但不限于用于递送序列(例如，基因序列，或用于基因编辑、基因敲入或敲低的模板)的载体或用于生物工程中，例如用于从纳米颗粒结构单元构建高度有序的材料。单链核酸可以具有各种几何形状，并且可以提供功能，例如适配体和核酸酶。如果单链核酸用作载体，则这些可以用于将核酸序列/片段直接转移到靶细胞或被另外的组分包封。

技术介绍

[0002]人们越来越认识到核酸在细胞内承担的功能，所述功能不仅仅是编码蛋白质的生产。双链结构就其本质而言已经被广泛研究，但应当理解，由于互补核苷酸之间的碱基配对，所述双链结构可以在细胞中形成刚性组装。核酸的最柔性区域通常是非碱基配对的，并且包含参与细胞内的重要过程的单链脱氧核糖核酸(ssDNA)和核糖核酸(ssRNA)区域。例如，双链DNA(dsDNA)被如DNA聚合酶等酶解旋，从而暴露ssDNA部分。然后这些部分可用于转录成ssRNA，如信使RNA(mRNA)，或用于与识别ssDNA的其它蛋白质相互作用。
[0003]单链核酸分子是将核酸递送到细胞的领域的技术人员特别感兴趣，因为核酸在经转染的细胞内是立即可获得的，并且不需要通过合适的酶“解旋”以暴露相关的基因信息(例如，用于转录和翻译或插入到基因组中)。单链核酸分子被认为是用于若干种应用的最佳递送载体，尤其是基因转移、基因编辑和生物传感。另一个潜在应用是提供DNA疫苗。可替代地，单链DNA可以具有与其构象相关的功能，即作为适配体。然而，较长的单链核酸(例如长度在数千个核苷酸的范围内的单链核酸)目前生产效率低下或不准确，从而限制了所述单链核酸的效用，如下文进一步讨论的。产生长寡核苷酸的最常见的方法是将序列克隆到质粒中以在细菌中培养，随后是限制性消化和纯化dsDNA序列，然后将其进行链剥离以产生ssDNA。尽管存在细菌繁殖问题，但仍存在许多效率低下和纯化问题。整个质粒主链序列被扩增，并且然后必须与细菌基因组一起被分离和丢弃。剥离二级链以揭示单链核酸分子又进一步降低了另外百分之五十的效率。
[0004]为了利用单链核酸的治疗潜力，需要一种高效且可扩展的制造方法，以制备商业规模的大量材料。目前的技术在以具有成本效益、准确、快速且安全的方式扩大规模生产材料的能力方面受到限制。还期望准确地产生长度为200个个核苷酸或更长的单链分子。
[0005]ssDNA和dsDNA供体序列两者均可以充当有效的基因编辑模板，但是供体构建体的选择通常由待引入的序列的长度决定。ssDNA供体主要用于需要小编辑的应用，主要是因为已经发现产生较长的ssDNA是有问题的，如以上所讨论的。已经发现ssDNA模板在用于基因编辑时在修复特异性方面具有唯一优势(长ssDNA供体对基于CRISPR的敲入的设计和特异性(Design and specificity of long ssDNA donors for CRISPR
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based knock
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in),Han Li、Kyle A.Beckman、Veronica Pessino、Bo Huang、Jonathan S.Weissman、Manuel D.Leonetti bioRxiv 178905)，并且因此其用途是令人期望的。
[0006]就其本质而言，线性单链核酸在细胞内会迅速降解，因为游离的3'和5'末端可用于如单链核酸酶等酶，其“咀嚼”末端并破坏核酸。因此，需要为此目的提供稳定的单链核酸构建体，其中保护游离的3'和5'末端免于立即降解。
[0007]用于将基因物质递送到细胞的许多病毒载体具有单链基因组，无论是RNA还是DNA，并且因此在基因递送中使用单链核酸是有先例的。
[0008]例如，腺相关病毒(AAV)是一种有趣的基因疗法媒剂并且属于细小病毒家族，并且本质上依赖于与其它病毒(如腺病毒)的共感染，以便进行复制。AAV基本上是围绕约4.7千碱基(kb)的单链DNA基因组的蛋白质外壳。存在数百种唯一的AAV菌株。其单链基因组尤其含有Rep(复制)和Cap(衣壳)基因。这些编码序列在两端侧接有长度通常为145个核苷酸的反向末端重复序列(ITR)。
[0009]缺乏病毒DNA的重组AAV(rAAV)基本上是在基于蛋白质的纳米颗粒中保护的ITR侧接的转基因，所述纳米颗粒被工程化以用于DNA货物递送到细胞的细胞核中。设计这种rAAV载体的主要考虑因素是转基因的包装大小和两个ITR之间的相关序列。5kb(包含病毒ITR)似乎是目前的限制，以确保ITR侧接的转基因被包装。可替代地，可以将ITR侧接的转基因(或其它所关注序列)直接引入到细胞中而不进行包装，这意味着“人工基因组”确实可以更长。
[0010]本领域中通常使用的核酸分子，如源自病毒基因组的基因递送载体可能是有问题的，因为所述核酸分子可以在基因递送载体的受体中诱导免疫应答，因为免疫系统可以识别循环的“外来”DNA。如果DNA是在细菌细胞中产生的，则其将具有DNA甲基化的原核模式，其在真核生物中可能被认为是外来的，并且类似地被拒绝。例如，质粒(pDNA)是环状dsDNA分子，其是天然存在的可以稳定地代代相传的额外染色体DNA片段。质粒和其衍生物已经用作基因递送载体，并取得了不同程度的成功。
[0011]产生核酸载体的方法也可能是有问题的。在细菌细胞内制造核酸结构有终产物被脂多糖(LPS)、内毒素和其它原核特异性分子污染的风险。这些具有在真核生物体中产生免疫应答的能力，因为其是微生物病原体的有效指标。实际上，在任何基于细胞的系统内制造核酸载体都会导致来自细胞培养物的污染物存在于终产物中的风险，包含来自宿主细胞的基因组材料。在细胞内产生核酸是低效的，因为需要供应比合成方法更多的材料来产生核酸。除了成本问题之外，在许多情况下，细胞培养物的使用可能会给扩增过程的再现性带来困难。在细胞的复杂生物化学环境中，难以控制期望的核酸产物的质量和产率。也难以处理可能对在其中扩增核酸的细胞有毒的序列。重组事件也可能导致所关注核酸的忠实产生出现问题。
[0012]DNA可以在不使用细胞的情况下合成产生。寡核苷酸可以通过使用经修饰的核苷酸延伸链来化学合成。制备这些结构单元是有成本的。每个核苷酸的逐步添加都是不完善的过程(每个链被延伸的机会被称为“偶联效率”)，并且对于较长序列，大部分起始链将不会变成全长正确的产物。这排除了大规模生产长序列的可能—对于这些过程，在长度、准确性与规模之间始终必须有所牺牲。此类寡核苷酸的主要用途仍然在低至数百个核苷酸的范围内(例如，引物和探针)，并且最大准确长度被认为是长度为约300个核苷酸。通常，合成的寡核苷酸是长度约为15
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25个碱基的单链核酸分子。
[0013]合成过程的优选替代方案是依赖于模板的核酸酶促生产。用于合成核酸的无细胞
体外酶促过程避免了使用任何宿主细胞的需要，并且因此是有利的，特别是当生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于无细胞体外制造具有多价螯合末端的单链核酸构建体的核酸模板，所述核酸模板包括从5'到3'的编码以下元件的序列：i)第一加工基序，所述第一加工基序与第一构象基序相邻；ii)所述第一构象基序；iii)所关注序列；iv)第二构象基序，所述第二构象基序与第二加工基序相邻；v)所述第二加工基序，其中加工基序包含能够形成碱基配对部分的序列，所述碱基配对部分包含核酸内切酶的识别位点和相关切割位点，并且其中所述构象基序包含能够形成分子内氢键的至少一个序列。2.根据权利要求1所述的核酸模板，其中加工基序内的所述切割位点与构象基序相邻。3.根据前述权利要求中任一项所述的核酸模板，其中加工基序内的所述核酸内切酶的所述切割位点位于所述碱基配对部分的末端碱基对处。4.根据前述权利要求中任一项所述的核酸模板，其中构象基序包含能够形成分子内氢键的序列，所述分子内氢键用于固定所述单链核酸构建体的末端处的末端核苷酸。5.根据前述权利要求中任一项所述的核酸模板，其中所述单链核酸构建体包含以下中的任何一种或多种：i)适配体；ii)核酸酶；iii)用于基因编辑的向导序列。6.根据前述权利要求中任一项所述的核酸模板，其中所述分子内氢键在所述构象基序的序列中的核苷酸碱基之间形成，并且任选地允许所述构象基序呈现构象。7.根据权利要求6所述的核酸模板，其中所述核苷酸碱基之间的所述分子内氢键涉及沃森
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克里克碱基对(Watson
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Crick base pair)、胡斯坦碱基对(Hoogsteen base
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pair)或非规范碱基配对。8.根据前述权利要求中任一项所述的核酸模板，其中构象基序可以是能够呈现以下构象中的一种或者两种或更多种的组合的序列：i)四链体；ii)发夹；iii)十字形；iv)茎环；和/或v)假结。9.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：莱特比奥有限公司，
类型：发明
国别省市：