本申请涉及中华绒螯蟹Dsx基因相关技术领域，尤其涉及沉默中华绒螯蟹Dsx基因的dsRNA以及其应用。制备该dsRNA的模板cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。用于制备该dsRNA的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示。该dsRNA不仅可实现对中华绒螯蟹精巢特化Dsx基因的沉默，还能够调控中华绒螯蟹性别决定基因IAG的基因表达；该dsRNA对Dsx基因的沉默准确可靠、沉默效率高，为中华绒螯蟹单性化养殖及遗传改良提供了研究基础。遗传改良提供了研究基础。遗传改良提供了研究基础。
【技术实现步骤摘要】
沉默中华绒螯蟹Dsx基因的dsRNA以及其应用
[0001]本申请涉及中华绒螯蟹Dsx基因相关
，尤其涉及沉默中华绒螯蟹Dsx基因的dsRNA以及其应用。
技术介绍
[0002]中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)，俗称河蟹，隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)。因其肉质鲜美、营养丰富而成为中国重要的水产养殖蟹类之一。在其生产过程中，根据不同需要，通过单性化养殖，实现河蟹全雄或全雌养殖可以节约养殖成本，提高生产效率，进而在满足消费者需求的同时创造出更大的经济效益。因此，中华绒螯蟹的性别决定与性腺分化机制越来越受到人们的关注。
[0003]Doublesex(Dsx)基因最早是在果蝇中被发现的，作为昆虫性别级联系统中的关键基因，Dsx基因的结构和功能在不同昆虫中具有保守性，可调节下游基因的表达来参与雌雄性别的决定和分化。Dsx基因编码的DSX蛋白主要包括两部分，其N端包含一个能与DNA结合的保守基序DM(doublesex and mab
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3)结构域，此结构域是DSX蛋白结合下游靶标基因的重要位点；而C端的OD2结构域激活或者抑制下游靶标基因的表达，进而起到调控个体性腺分化的作用。研究发现，河蟹的Dsx基因与昆虫Dsx基因高度同源(见刘志强，中华绒螯蟹雌雄个体早期形态分化及雄性个体中性别相关基因的研究[D].上海海洋大学，2018)。虽然Dsx基因的功能在昆虫性别决定的研究中已阐明，但河蟹关于Dsx基因的报道还未见。因此，有必要在河蟹中开展Dsx基因的功能研究，并应用于河蟹的性别决定与性腺分化中。
技术实现思路
[0004]有鉴于此，本申请的目的在于针对Dsx基因的表达进行研究，以利于将其应用于中华绒螯蟹的性别决定和性腺分化研究中。
[0005]第一方面，本申请实施例公开了制备dsRNA的模板cDNA，所述模板cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，所述dsRNA用于沉默中华绒螯蟹Dsx基因。
[0006]第二方面，本申请实施例公开了所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示。
[0007]第三方面，本申请实施例公开了连接有所述的模板cDNA的重组表达载体。
[0008]第四方面，本申请实施例公开了携带有所述的重组表达载体的宿主。
[0009]第五方面，本申请实施例公开了制备所述的dsRNA的方法，包括以下步骤：
[0010]获得所述模板cDNA；
[0011]PCR扩增，利用所述引物对对所述模板cDNA进行扩增，得到长度为571bp的靶序列；
[0012]构建重组表达载体，所述重组表达载体连接有所述靶序列片段；
[0013]获得转化有所述重组表达载体的大肠杆菌菌体；
[0014]诱导表达所述大肠杆菌菌体；以及
[0015]得到所述dsRNA，由所述大肠杆菌菌体诱导表达后，经过菌体裂解、RNA提取、变性、
退火和纯化得到所述dsRNA。
[0016]在本申请实施例中，所述PCR扩增体系为：10
×
Buffer 5μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，cDNA模板1μL，Taq聚合酶1.0μL，dd H2O补足50μL；所述PCR扩增反应条件为：98℃预变性30s；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共循环30次后；72℃延伸10min。
[0017]在本申请实施例中，大肠杆菌菌体诱导表达后的步骤包括：
[0018]收集菌体，利用Trizol Reagent提取上述细胞总RNA后，于72℃水浴条件下对上述总RNA变性处理10min，自然冷却至室温后，退火即可形成靶向Dsx基因的dsRNA。
[0019]第六方面，本申请实施例公开了沉默中华绒螯蟹Dsx基因表达的方法，包括对中华绒螯蟹注射包含所述dsRNA的试剂的步骤。
[0020]第七方面，本申请实施例公开了所述的dsRNA或所述的模板cDNA的应用，所述应用包括以下任一项：
[0021](1)在中华绒螯蟹杂交育种中的应用；
[0022](2)在中华绒螯蟹单性化养殖中的应用；
[0023](3)在中华绒螯蟹遗传改良中的应用。
[0024]与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
[0025]本申请中涉及一种靶向中华绒螯蟹精巢特化表达的Dsx基因的dsRNA，该dsRNA不仅可实现对中华绒螯蟹精巢特化Dsx基因的沉默，还能够调控中华绒螯蟹性别决定基因IAG的基因表达；该dsRNA对Dsx基因的沉默准确可靠、沉默效率高，为中华绒螯蟹单性化养殖及遗传改良提供了研究基础。
附图说明
[0026]图1为本申请实施例提供的中华绒螯蟹总RNA的电泳检测图；左泳道为Marker，右泳道为总RNA样本。
[0027]图2为本申请实施例提供的中华绒螯蟹Dsx基因的RNAi靶序列的电泳检测图；左泳道为Marker，右泳道为RNAi靶序列PCR结果。
[0028]图3为本申请实施例提供的重组表达载体的双酶切电泳图；左泳道为Marker，右泳道为重组表达载体的双酶切产物。
[0029]图4为本申请实施例对目的片段的测序鉴定结果。
[0030]图5为本申请实施例提供的原核表达制备靶向Dsx基因的dsRNA(经RNase A处理过)的电泳检测图；M泳道为Marker；1泳道为IPTG诱导后退火形成的dsRNA样本；2泳道为未经IPTG诱导的样本；3泳道为IPTG诱导L4440空载体样本。
[0031]图6为本申请实施例提供的RNA干扰中华绒螯蟹24h后性别相关Dsx和IAG基因mRNA的定量检测结果。
具体实施方式
[0032]为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
[0033]本申请专利技术人长期实践和研究中创造性发现了一种靶向中华绒螯蟹精巢特化表
达的Dsx基因的dsRNA，该dsRNA不仅可实现对中华绒螯蟹精巢特化Dsx基因的沉默，还能够调控中华绒螯蟹性别决定基因IAG的基因表达；该dsRNA对Dsx基因的沉默准确可靠、沉默效率高，为中华绒螯蟹单性化养殖及遗传改良提供了研究基础。
[0034]为了进一步说明本专利技术，下面结合实施例对本专利技术提供的沉默中华绒螯蟹精巢特化表达的Dsx基因的dsRNA制备过程以及沉默效果进行详细说明，但不能将它们理解为对本专利技术保护范围的限定。下方未特别说明的试剂或仪器均可从常规商业途径获得，其中未特别说明的实验方法均为本领域常规实验方法。
[0035]一、试验材料及来源
[0036]Trizol Reagent总RNA提取试剂盒、Taq聚合酶、RNase
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Free DNase I、R本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.制备dsRNA的模板cDNA，所述模板cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，所述dsRNA用于沉默中华绒螯蟹Dsx基因。2.用于制备权利要求1所述的dsRNA的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示。3.连接有权利要求2所述的模板cDNA的重组表达载体。4.携带有权利要求3所述的重组表达载体的宿主。5.制备权利要求1所述的dsRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：获得如权利要求1所述的模板cDNA；PCR扩增，利用权利要求2所述的引物对对所述模板cDNA进行扩增，得到长度为571bp的靶序列片段；构建重组表达载体，所述重组表达载体连接有所述靶序列片段；获得转化有所述重组表达载体的大肠杆菌菌体；诱导表达所述大肠杆菌菌体；以及得到所述dsRNA，由所述大肠杆菌菌体诱导表达后，经过收集菌体、提取RNA、变性、退火和纯化得到所述dsRNA。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系为：10
【专利技术属性】
技术研发人员：马克异，邱高峰，王龙，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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