一种重组人胶原蛋白、编码基因及其在制备可生物降解的胶原基角膜替代物上的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组人胶原蛋白、编码基因及其在制备可生物降解的胶原基角膜替代物上的应用，它是将重组人胶原蛋白和高分子聚合物，于水相中通过复合交联方式处理，模具固化成型后获得；或将重组人胶原蛋白和高分子聚合物采用静电纺丝为纳米纤维膜后，进一步进行复合交联、干燥获得三维角膜支架，临床时复水溶胀后添加富血小板血浆使用。本发明专利技术的角膜替代物无病毒隐患、无免疫原性、降解性可控，具有良好的屈光性和机械强度，添加富血小板血浆(APRP)使用后对角膜上皮细胞及角膜小体、角膜神经的再生具有显著的诱导作用。神经的再生具有显著的诱导作用。

【技术实现步骤摘要】
一种重组人胶原蛋白、编码基因及其在制备可生物降解的胶原基角膜替代物上的应用


[0001]本专利技术属于组织工程角膜移植物材料
，具体地，本专利技术涉及一种重组人胶原蛋白、编码基因及其在制备可生物降解的胶原基角膜替代物上的应用。

技术介绍

[0002]世界上超过1000万人的眼盲是由角膜病引起，为导致眼盲的第二大原因，仅次于白内障。穿透性角膜移植术是角膜病主要的洽疗手段，但对于重度干眼症、Stevens
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Johnson综合症、重度化学烧伤等的预后较差，且面临移植排斥、供体不足等问题。人工角膜的应用和组织工程角膜的研究为眼盲患者带来了希望，目前常用的角膜构建材料主要为生物支架材料、高分子材料等。
[0003]生物材料支架常作为机械支架支持细胞生长，减轻细胞反应，并随着时间的推移，逐渐改变它们的化学和机械特性。生物相容性是其最重要的一个特性，生物材料越接近组织微环境，生物相容性越好。理想的组织工程角膜材料应满足以下条件：(1)生物相容性好，维持三维空间，促进正常细胞生长和分化，不干扰其他生理过程；(2)无不良组织反应；(3)材料制作简单，并能按不同的形状和大小重塑；(4)植入体内后，材料可被降解或吸收。
[0004]胶原蛋白是动物体内含量最多的结构蛋白，具有很强的生物活性及生物功能，为细胞生长提供依附和支撑，能诱导上皮细胞、纤维细胞等进行黏附、增殖和迁移，使结缔组织具有机械强度；同时，具有止血、生物相容性和生物降解性；还能改善细胞生长微环境，促进皮肤组织新陈代谢，修复皮肤屏障，能够引导机体组织再生。基于这些特征，胶原蛋白常被用于组织工程领域、医疗器械领域及美容领域。
[0005]富血小板血浆(APRP)是自体全血离心后获得的血小板浓缩物，含有大量细胞生长因子，如血小板原性生长因子，转化生长因子、神经生长因子、表皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子等。这些生长因子不仅能在多种组织修复与再生过程中起促进作用，还能促进细胞增殖、分化、趋化等加速神经、血管再生。APRP中还具有高浓度血小板及白细胞，能充分发挥抗菌作用，避免创口的感染。
[0006]申请号为200510042812.3的中国专利技术专利申请公开了一种具有生物活性的人工角膜的制备方法，以动物角膜基质为材料，采用酶消化、反复冻融、洗涤、
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Co辐照、复合添加促进角膜细胞生长或/和阻止局部病变发展的功能组分的步骤制备。该专利技术叙述其具有与正常角膜相似的拉伸强度、屈光度，阻止病变发展及角膜溶解，促角膜上皮再生等优点。但是，采用动物角膜基质为材料，存在异种胶原免疫排斥反应，细胞毒反应等风险因素。
[0007]申请号为201510453581.9的中国专利技术专利申请公开了一种组织工程角膜的制备方法，具体为采用人角膜缘细胞复合动物源性角膜制备的支架材料的方式，将前弹力层、基质层和后弹力层分离，涂布人角膜缘细胞制备的细胞混悬液，后通过交联、粘合等方式完成含细胞的组织工程角膜构建，此方法制备的组织工程角膜在使用方面具有组织相容性高、细胞不易分化、可以产业化制备等优点。但该方法未考虑承载细胞生物材料的保存期问题，
难以形成市场化角膜替代物，不利于市场推广，且外源性细胞与动物源材料混合型产品的免疫排斥风险较高，产品植入后提供光线屈光性作用也很难保证。
[0008]申请号为200910068343.0的中国专利技术专利申请公开了一种具有生物活性的胶原基复合角膜替代物及其制备方法，主要是以胶原、3
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(甲基丙烯酰胺)丙基
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二甲基(3
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磺丙)胺(MPDSAH)为原料，以水为溶剂，以碳二亚胺(EDC)对胶原进行交联；以IRGACURE 2959为光引发剂，聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)为交联剂对MPDSAH进行引发聚合并交联。混合均匀后，注入模具内固化成型。该方法制备的复合角膜替代物可诱导和促进角膜再生，可随角膜再生而生物降解，生长因子的引入可以促进自体生长因子的富集，减少术后并发症的出现。但该方法所用的聚合物MPDSAH及光引发剂为刺激类试剂，生物相容性较差，且后期保存采用氯仿溶液，不如当前湿热或辐照等终端灭菌方式安全性高。
[0009]上述专利中公开的人工角膜都存在一定的不足，无法兼顾生物相容性、生物安全性和角膜移植后的有效性，同时部分产品难以市场化，不具备临床应用价值。

技术实现思路

[0010]本专利技术要解决的技术问题包括：第一在于提供一种重组人胶原蛋白及其对应的编码基因，第二是于提供一种质量稳定、生物安全性高、可生物降解的胶原基角膜替代物，以及该角膜替代物的制备及应用方法。
[0011]本专利技术提供的重组人胶原蛋白，该重组人胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：
[0012]KREAEAGKDGPPGPAGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPLGIAGITGARGLAGPPGMPGPRGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGERGPPGPQGLPGLAGTAGEPGRDGNPGSDGLPGRDGSPGGKGDRGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAGPRGPVGPSGPPGKDGTSGHPGPIGPPGPRGNRGERGSEGSPGHPGQPGPPGPPGAPGPCCGGVGAAAIAGIGGEKAGGFAPYYG
[0013]本专利提供设计长度为328氨基酸的人胶原蛋白(SEQ ID NO:1)，并根据毕赤酵母密码子的偏好性设计相应核苷酸序列(SEQ ID NO:2)，将该核苷酸序列插入毕赤酵母表达载体，构建pPIC9K
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COL表达载体，通过电转化将该表达载体转化毕赤酵母宿主菌GS115，通过筛选获得高拷贝数菌株，最后经过高密度发酵、分离、纯化获得高纯度的重组人源胶原蛋白原料。
[0014]本专利技术的重组人源胶原蛋白稳定性好，纯度高，能够满足本专利技术的需要。另外，本专利技术还提供编码上述重组人源胶原蛋白氨基酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸的DNA序列包括SEQ ID NO:2：
[0015]AAAAGAGAGGCTGAAGCTGGAAAAGATGGTCCTCCTGGTCCTGCTGGTAATACTGGTGCTCCTGGTAGTCCTGGTGTCAGTGGTCCTAAGGGTGACGCTGGTCAACCTGGTGAAAAGGGTTCTCCAGGTGCTCAAGGTCCACCTGGTGCTCCAGGTCCTTTGGGTATTGCTGGTATTACTGGTGCTAGAGGTTTGGCTGGTCCACCTGGTATGCCAGGTCCTAGAGGTTCTCCAGGTCCTCAAGGTGTTAAGGGTGAATCTGGTAAACCAGGTGCTAACGGTTTGTCCGGAGAGAGAGGTCCACCT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人胶原蛋白，其特征在于，该重组人胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的DNA序列如SEQ ID NO:2所示。3.权利要求1所述的重组人胶原蛋白在制备可生物降解的胶原基角膜替代物上的应用。4.一种制备可生物降解的胶原基角膜替代物的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将权利要求1所述的重组人胶原蛋白和高分子聚合物按质量比为0.1～10:1混合，得到胶原基共混物；（2）复合交联：将胶原基共混物和交联剂进行进行复合交联；（3）交联反应完后除去交联剂，干燥、灭菌，获得角膜替代物；（4）临床使用之前将角膜替代物置于添加富血小板血浆（APRP）的PBS溶液中于4℃溶涨3～4天，待角膜完全恢复形变后进行临床应用。5.根据权利要求4所述的制备可生物降解的胶原基角膜替代物的方法，其特征在于，高分子聚合物为聚乙烯醇、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸
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羟基乙酸共聚物中的一种或多种；上述的APRP为自体富血小板血浆或者异体富血小板血浆。6.根据权利要求4所述的制备可生物降解的胶原基角膜替代物的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷世清，赵学彩，张凤龙，蔡永刚，魏静，孙晖，李倩，张甲庆，李鑫，
申请(专利权)人：山东汉肽医美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：