一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术提供了一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法，所述方法将类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物于pH为6.0～8.0、温度为2～8℃的条件下反应以制得聚乙二醇化类胶原蛋白；与现有其他制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法相比，使用本发明专利技术的方法制得的聚乙二醇化类胶原蛋白交联性能更佳，将使用本发明专利技术的方法制得的聚乙二醇化类胶原蛋白制成水凝胶形成角膜后，在强度上可较使用现有方法制得的聚乙二醇化类胶原蛋白提高10倍以上，并且，使用本发明专利技术的方法制备聚乙二醇化类胶原蛋白的反应时间更短，仅需反应5～8h即可获得能制成水凝胶形成角膜的聚乙二醇化类胶原蛋白。胶原蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法及其应用，属于生物


技术介绍

[0002]角膜(Cornea)是眼睛最前面的凸形高度透明物质，呈横椭圆形，覆盖虹膜、瞳孔及前房，并为眼睛提供大部分屈光力。加上晶体的屈光力，光线便可准确地聚焦在视网膜上构成影像。角膜有十分敏感的神经末梢，如有外物接触眼角膜，眼睑便会不由自主地合上以保护眼睛。为了保持透明，角膜并没有血管，透过泪液及房水获取养份及氧气。
[0003]角膜十分脆弱，眼部外伤、炎症、过敏反应、物理损伤、化学灼伤、剧烈运动、用眼过度等均会导致角膜病变。角膜一旦病变，会导致明显的眼部症状，比如眼睛的疼痛、畏光、流泪、视力下降等，严重的还会导致失明。
[0004]角膜移植就是用正常的角膜替换患者现有的病变角膜，使患眼复明或控制角膜病变，达到增进视力或治疗某些角膜疾患的治疗方法。一些引起患者严重视力受损甚至是失明的角膜疾病，通过进行角膜移植的方法，完全可以治疗，帮助这些不幸的患者远离痛苦。因为角膜本身不含血管，处于“免疫赦免”地位，使角膜移植的成功率位于其他同种异体器官移植之首。
[0005]然而，角膜资源有限，远不能满足患者需求。为解决这一问题，有研究者提出了人工角膜移植术。人工角膜移植术是用透明的医用高分子材料制成的特殊光学装置，通过手术将它植入角膜组织中，以取代部分角膜瘢痕组织，而重新恢复视力的一种手术方法。由于角膜组织对人工合成材料的排异反应等问题尚未解决，远期效果不佳，常造成移植处的房水渗漏及移植片的脱落，故目前尚不可能广泛应用。现阶段人工角膜仅适用于患各种严重角膜疾患后的双目失明，特别是严重的化学烧伤引起的全部角膜白斑和多次角膜移植术失败，无法再做其他手术者。
[0006]在人工角膜的基础上，又有研究者提出了仿生角膜。例如，文献“Short peptide analogs as alternatives to collagen in pro
‑
regenerative corneal implants”中，Jangamreddy,Jaganmohan R.等人提出了一种聚乙二醇化类胶原蛋白，将此聚乙二醇化类胶原蛋白经化学交联，即可获得仿生角膜。此仿生角膜生物相容性极好，可有效解决角膜组织对人工合成材料的排异反应强烈等问题。
[0007]但是，此仿生角膜的强度很低，仅有0.022MPa，若将此仿生角膜用于角膜移植，尚存在移植难度大、容易引起角膜圆锥等问题。

技术实现思路

[0008]为解决现有仿生角膜强度低的问题，本专利技术提供了一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
[0009]反应步骤：将类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物于pH为6.0～8.0、温度为2～8℃的条
件下进行反应，得到反应产物；所述反应产物中含有上述聚乙二醇化类胶原蛋白。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应步骤中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的投料摩尔数比为1～16:1。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应步骤中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的投料摩尔数比为8～12:1。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应步骤中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的反应溶剂为水或稀盐酸溶液。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述稀盐酸溶液的浓度为1～10mmol/L；所述稀盐酸溶液的pH用稀碱溶液调节至6.0～8.0。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述稀碱溶液为pH 9.0～11.0的氢氧化钠溶液或氨水。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应步骤中，类胶原蛋白在反应溶剂中的投料浓度为1～15mg/mL。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应步骤中，类胶原蛋白在反应溶剂中的投料浓度为8～10mg/mL。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，反应步骤后，所述方法还包含纯化步骤；所述纯化步骤为：通过过滤截留反应产物中分子量大于等于30000Da的物质，得到聚乙二醇化类胶原蛋白。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述过滤为透析或超滤。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应的时间为1～48h。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应的时间为5～8h。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，所述类胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1中，X为4Hyp(4
‑
羟脯氨酸)，即：
[0022]SEQ ID NO.1的氨基酸序列为：
[0023]H
‑
Pro
‑
Lys
‑
Gly
‑
Pro
‑
Lys
‑
Gly
‑
Pro
‑
Lys
‑
Gly
‑
Pro
‑
Lys
‑
Gly
‑
Pro
‑
Hyp
‑
Gly
‑
Pro
‑
Hyp
‑
Gly
‑
Pro
‑
Hyp
‑
Gly
‑
Pro
‑
Hyp
‑
Gly
‑
Asp
‑
Hyp
‑
Gly
‑
Asp
‑
Hyp
‑
Gly
‑
Asp
‑
Hyp
‑
Gly
‑
Asp
‑
Hy p
‑
Gly
‑
OH
[0024]在本专利技术的一种实施方式中，所述聚乙二醇衍生物包含PEG
‑
40k、PEG
‑
20k、PEG
‑
10k或PEG
‑
5k中的一种或一种以上。
[0025]在本专利技术的一种实施方式中，所述聚乙二醇衍生物的活化基团数为8
‑
arm、4
‑
arm、2
‑
arm或1
‑
arm中的一种或一种以上。
[0026]在本专利技术的一种实施方式中，所述聚乙二醇衍生物的活化基团数为4
‑
arm或8
‑
arm。
[0027]在本专利技术的一种实施方式中，所述聚乙二醇衍生物的活化基团为
‑
MAL、
‑
NHS、
‑
SG、
‑
SPA、
‑
SS或
‑
EDC中的一种或一种以上。
[0028]在本专利技术的一种实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：反应步骤：将类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物于pH为6.0～8.0、温度为2～8℃的条件下进行反应，得到反应产物；所述反应产物中含有上述聚乙二醇化类胶原蛋白。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应步骤中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的投料摩尔数比为1～16:1。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应步骤中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的投料摩尔数比为8～12:1。4.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述反应步骤中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的反应溶剂为水或稀盐酸溶液。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述稀盐酸溶液的浓度为1～10mmol/L；所述稀盐酸溶液的pH用稀碱溶液调节至6.0～8.0。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述稀碱溶液为pH 9.0～11.0的氢氧化钠溶液或氨水。7.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述反应步骤中，类胶原蛋白在反应溶剂中的投料浓度为1～15mg/mL。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述反应步骤中，类胶原蛋白在反应溶剂中的投料浓度为8～10mg/mL。9.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，反应步骤后，所述方法还包含纯化步骤；所述纯化步骤为：通过过滤截留反应产物中分子量大于等于30000Da的物质，得到聚乙二醇化类胶原蛋白。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述过滤为透析或超滤。11.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述类胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。12.一种聚乙二醇化类胶原蛋白，其特征在于，所述聚乙二醇化类胶原蛋白是使用权利要求1～11任一项所述的方法制备得到的。13.一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的冻干制剂的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：冻干步骤：将使用权利要求1～11任一项所述的方法制得的聚乙二醇化类胶原蛋白进行冻干，得到冻干制剂。14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述冻干步骤为：将聚乙二醇化类胶原蛋白和冻干保护剂混合后进行冻干，得到冻干制剂。15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述冻干保护剂为甘露醇、蔗糖或丙氨酸中的一种或一种以上。16.如权利要求13～15任一项所述的方法，其特征在于，所述冻干包括如下阶段：阶段一：于温度为
‑
45℃、真空度(vacuum)为500m Torr的条件下冻干6h；阶段二：于温度为
‑
30℃、真空度(vacuum)为100m Torr的条件下冻干17h；阶段三：于温度为25℃、真空度(vacuum)为100m Torr的条件下冻干7h。17.一种聚乙二醇化类胶原蛋白的冻干制剂，其特征在于，所述冻干制剂是是使用权利要求13～16任一项所述的方法制备得到的。
18.权利要求1～11任一项所述的方法制备得到的聚乙二醇化类胶原蛋白或权利要求12所述的聚乙二醇...

【专利技术属性】
技术研发人员：王崇宇，张加慧，张军，刘沐荣，何超先，
申请(专利权)人：熹微苏州生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：