一种鲟鱼软骨Ⅱ型非变性胶原及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种鲟鱼软骨Ⅱ型非变性胶原及其制备方法和应用，是使用碱液处理鲟鱼软骨后，进行匀浆处理，再用添加了盐酸胍的Tris

【技术实现步骤摘要】
一种鲟鱼软骨Ⅱ型非变性胶原及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于动物胶原蛋白提取
，具体涉及一种鲟鱼软骨Ⅱ型非变性胶原及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]水生生物体内具有丰富的软骨资源，且与陆生动物相比，水生生物胶原具有安全性、低过敏性和低抗原性等良好的生化特性及独特的优点，所以水生生物Ⅱ型胶原蛋白的制备及应用值得关注。
[0003]鲟鱼软骨中含有丰富的Ⅱ型胶原蛋白和多糖等活性成分，具有重要的生理学作用，但未被重视和利用。Ⅱ型胶原蛋白作为软骨基质的主要成分之一，可以促进软骨细胞分化并改善骨骼健康，特别对治疗类风湿性关节炎疾病有积极的作用。
[0004]鲟鱼是现有的淡水鱼类中体形较大、寿命较长的一种鱼类，因其具有很高的营养价值和经济价值，使得我国鲟鱼的养殖面积和养殖产量逐年递增。鲟鱼体格大,且除了部分骨化的鱼鳍和头部的一块真骨外,其它部分的骨骼均为软骨，在鲟鱼深加工过程中，产生大量的副产物鱼骨，其中含有丰富的胶原蛋白，是提取Ⅱ型胶原蛋白的良好原料。
[0005]目前,国内外的胶原蛋白提取方法主要有碱法,热水提取,盐法,酸法,酶法等。这些方法有的会造成胶原肽键水解,含羟基、巯基的氨基酸全部被破坏，使胶原蛋白变性，有的会导致大量的胶原蛋白流失。酶法生产胶原蛋白反应条件温和，不破坏胶原蛋白的三股螺旋结构，能保持其特性而被广泛应用。然而，现有的酶解技术在常温常压甚至于高温高压下进行，酶解、浓缩、干燥过程均需较高的温度，对胶原蛋白活性影响较大，产品品质难以保证。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供一种鲟鱼软骨Ⅱ型非变性胶原及其制备方法和应用，从而弥补现有技术的不足。
[0007]本专利技术所提供的鲟鱼软骨Ⅱ型非变性胶原，其制备方法如下：
[0008]使用碱液处理鲟鱼软骨后，进行匀浆处理，再用添加了盐酸胍的Tris
‑
HCl缓冲液清洗处理后，使用添加在酸液中的胃蛋白酶进行酶解，酶解液进行离心收集上清液；上清液进行盐析；并离心收集沉淀产物；沉淀产物使用酸溶液进行复溶后，溶液再进行透析，透析液进行冷冻干燥制得鲟鱼软骨Ⅱ型非变性胶原；
[0009]作为实施例的一种具体记载，其中碱液为0.02mol/L
‑
0.1mol/L的NaOH溶液；
[0010]其中添加了盐酸胍的Tris
‑
HCl缓冲液，是添加了1mol/L盐酸胍的0.05mol/L Tris
‑
HCl缓冲液，pH 7.5；
[0011]所述的酶解，其条件为液料比为1:10
‑
1:20(w/v)，乙酸浓度为0.5mol/L，加酶量为底物质量的0.3％
‑
0.5％，酶解时间为48h；
[0012]作为优选，其中液料比为15:1，乙酸浓度为0.5mol/L，加酶量为0.4％。
[0013]所述的盐析，其中加入NaCl至终浓度为0.9
‑
1.2mol/L；
[0014]所述的离心，其条件为4℃，转速9000g，时间20
‑
30min；
[0015]本专利技术以鲟鱼加工的副产物鲟鱼软骨为原料，提供了一种鲟鱼软骨资源深加工与应用的方法，丰富了市场上的胶原蛋白产品。本专利技术所提取的Ⅱ型胶原保持了胶原的三螺旋结构及其活性，大大提高了产品的应用价值。且本专利技术所提取的Ⅱ型胶原提取率高。
附图说明
[0016]图1为加酶量对提取率影响的三维曲面图；
[0017]图2为液料比对提取率影响的三维曲面图；
[0018]图3为乙酸浓度对提取率影响的三维曲面图；
[0019]图4为鲟鱼软骨CII的紫外
‑
可见吸收光谱图；
[0020]图5为鲟鱼软骨CII的傅里叶变换红外光谱；
[0021]图6为鲟鱼软骨CII的圆二色光谱；
[0022]图7为鲟鱼软骨CII的X
‑
射线衍射图谱。
具体实施方式
[0023]本专利技术实施例中采用的具体检测方法记载如下：
[0024]1、氨基酸组成分析
[0025]取样品置于安瓿瓶中，加入10mL，6mol/L的盐酸(含5
‰
巯基乙醇)溶液，充氮气后用酒精喷枪封住瓶口。110℃水解22h，冷却。加超纯水定容至50mL。取1mL水解液蒸干，再加3
‑
5滴超纯水继续蒸干，重复3次以排酸，最后溶于2mL 0.02mol/L盐酸，过0.22μm水系膜，通过自动氨基酸分析仪进行分析。
[0026]2、紫外
‑
可见吸收光谱分析
[0027]用0.5mol/L的乙酸溶液配制0.25mg/mL的胶原样品溶液。基线是0.5mol/L的乙酸溶液。通过紫外分光光度计(UV
‑
2102PC)对样品进行扫描分析；扫描范围：190
‑
400nm，以中速扫描。
[0028]3、傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析
[0029]将光谱纯溴化钾烘干至恒重，和适量样品在研钵中进行研磨混合后，压制成均匀透明的薄片。分辨率：2cm
‑1，扫描范围：4000
‑
500cm
‑1，扫描次数：32。使用OMNIC 9.0软件分析峰值和波长值。
[0030]4、圆二色光谱(CD)分析
[0031]用0.5mol/L乙酸溶解CⅡ样品，得到0.25mg/mL的溶液。以9000
×
g，4℃离心20min，取上清液，进行圆二光谱分析。扫描速度：50nm/min；扫描间隔：0.1nm；扫描波长：190
‑
300nm。用0.5mol/L的乙酸溶液来设置基线。
[0032]5、X
‑
射线衍射分析
[0033]通过X射线衍射仪对样品进行X
‑
射线衍射分析。射线源：Cu靶Ka辐射，辐射波长：电压：40kV，电流：40mA。扫描角度：5
°‑
50
°
(2θ)，扫描速度：4
°
/min。
[0034]6、肽质量指纹图谱分析
[0035](1)胰蛋白酶溶液：取适量质谱纯胰蛋白酶，溶于0.1mol/L的NH4HCO3溶液，终浓度
为1mg/mL。
[0036](2)胶原样品的处理：用乙酸(0.1mol/L)溶解，得到浓度为10mg/mL的CⅡ样品溶液。与0.1mol/L NH4HCO3溶液(1:1,v:v)混合均匀，在50℃水浴锅中反应3h，然后以9000
×
g离心20min后得到上清液。然后与胰酶溶液以25:1(v:v)混合均匀，37℃酶解20h。通过微量层析柱脱盐，过膜。
[0037]利用MaxQuant(版本1.5.0.12)进行数据分析，选用uniprot的胶原蛋白数据库(uniport
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鲟鱼软骨Ⅱ型非变性胶原的制备方法，其特征在于，所述的制备方法的步骤如下：使用碱液处理鲟鱼软骨后，进行匀浆处理，再用添加了盐酸胍的Tris
‑
HCl缓冲液清洗处理后，使用添加在酸液中的胃蛋白酶进行酶解，酶解液进行离心收集上清液；上清液进行盐析；并离心收集沉淀产物；沉淀产物使用酸溶液进行复溶后，溶液再进行透析，透析液进行冷冻干燥制得鲟鱼软骨Ⅱ型非变性胶原。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的碱液为0.02
‑
0.1mol/L的NaOH溶液。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的添加了盐酸胍的Tris
‑
HCl缓冲液，是添加了1mol/L盐酸胍的0.05mol/L Tris
‑
HCl缓冲液。4.如权利要求1所述的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯虎，白雪，李兆霞，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：