【技术实现步骤摘要】
一种重组巴斯德毕赤酵母菌株、其构建方法和应用
[0001]本专利技术属于微生物基因工程与代谢工程应用领域,具体涉及一种利用甲醇生产脂肪酸衍生物的重组巴斯德毕赤酵母的构建方法、优化及其应用。
技术介绍
[0002]当前世界快速发展的城市化建设与工业化进程导致了前所未有的对于化石燃料的依赖性,液体运输燃料的需求量逐年递增。目前,全世界三分之一的能源来自于石油原料,其余来自煤炭、天然气、核能、水电和可再生能源(BP,2014),而大约80%的液体燃料来自石油(Floudas et al.Comput.Chem.Eng.,2012,41:24-51.)石油资源储备的快速消耗以及化石燃料使用产生的温室气体排放导致的气候变化等问题,已经成为现代社会面临的最大挑战之一,也促使人们寻找可以替代化石燃料的廉价可再生能源。燃料乙醇是目前最主要的生物燃料,可以大幅较少二氧化碳的排放,然而其带来的粮食与经济问题,以及燃料乙醇本身能量密度低和吸湿性限制其广泛应用(Hu et al.Open.Biol.,2019,9:190049.)。
[0003]脂肪酸类衍生物如脂肪醇、烷烃和烯烃等因其与当前使用的液体燃料具有相似的高能量密度和燃烧特性,可以用作航空与重型卡车燃料,是一种比生物乙醇更好的石油资源替代品(Sheng et al.Front.Microbiol.,2015,6:554.)。此外,脂肪酸及其衍生物也是重要的化工原料,如脂肪酸可以用来制造洗涤剂和表面活性剂;脂肪醇广泛应用于医药、化妆品、洗涤剂和护肤品的生产过程;α泛烯烃是制备 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种产脂肪酸的重组巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法,其特征在于,所述构建方法包括:构建具有SEQ ID NO:1所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gFAA1;将所述sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gFAA1导入巴斯德毕赤酵母菌株,敲除巴斯德毕赤酵母菌株中的KpFAA1基因。优选地,所述巴斯德毕赤酵母菌株整合有Cas9蛋白。2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述构建方法还包括:构建具有SEQ ID NO:2所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gFAA2;将所述sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gFAA2导入巴斯德毕赤酵母菌株,敲除巴斯德毕赤酵母菌株中的KpFAA2基因;优选地,所述构建方法还包括:构建具有SEQ ID NO:3所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gPOX1;将所述sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gPOX1导入巴斯德毕赤酵母菌株,敲除巴斯德毕赤酵母菌株中的KpPOX1基因;优选地,所述构建方法还包括:使所述重组巴斯德毕赤酵母菌株过表达由基因MmACL编码的柠檬酸裂解酶、由基因KpIDP2编码的异柠檬酸脱氢酶2和由基因ScYHM2编码的柠檬酸转运蛋白;其中,所述重组巴斯德毕赤酵母菌株过表达来自毕赤酵母的基因KpRAD52并且敲除了KpFAA1基因;进一步优选地,使所述重组巴斯德毕赤酵母菌株过表达由基因MmACL编码的柠檬酸裂解酶包括:将来源于小家鼠的基因MmACL整合至所述重组巴斯德毕赤酵母菌株中;进一步优选地,使所述重组巴斯德毕赤酵母菌株过表达由基因MmACL编码的柠檬酸裂解酶包括:构建具有SEQ ID NO:7所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gPNSI-2;将所述sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gPNSI-2导入所述重组巴斯德毕赤酵母菌株;进一步优选地,使所述重组巴斯德毕赤酵母菌株过表达由基因KpIDP2编码的异柠檬酸脱氢酶2包括:将来源于毕赤酵母的KpIDP2整合至巴斯德毕赤酵母基因组PNSI-3位点,使KpIDP2基因过表达;进一步优选地,使所述重组巴斯德毕赤酵母菌株过表达由基因KpIDP2编码的异柠檬酸脱氢酶2包括:构建具有SEQ ID NO:9所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gPNSI-3;将所述sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gPNSI-3导入所述重组巴斯德毕赤酵母菌株;进一步优选地,使所述重组巴斯德毕赤酵母菌株过表达由基因ScYHM2编码的柠檬酸转运蛋白包括:将来源于酿酒酵母的基因ScYHM2整合至所述重组巴斯德毕赤酵母菌株中;进一步优选地,使所述重组巴斯德毕赤酵母菌株过表达由基因ScYHM2编码的柠檬酸转运蛋白包括:构建具有SEQ ID NO:10所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gPNSI-4;
将所述sgRNA表达载体pPICZ-Cas9-gPNSI-4导入所述重组巴斯德毕赤酵母菌株;优选地,KpFAA1基因具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列;KpFAA2基因具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列;KpPOX1基因具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列;MmACL基因具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列;KpIDP2基因具有如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列;ScYHM2基因具有如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述重组巴斯德毕...
【专利技术属性】
技术研发人员:周雍进,蔡鹏,纪璐璐,
申请(专利权)人:中国科学院大连化学物理研究所,
类型:发明
国别省市:
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