本发明专利技术提供一种用于检测新型冠状病毒orf1ab和S基因的试剂盒，涉及试剂盒检测技术领域，包括RT‑PCR反应液、RT‑PCR反应酶系、阳性质控品和阴性质控品，所述RT‑PCR反应液中含有PCR缓冲液、特异性的正、反向引物和异性荧光探针。本发明专利技术特异性、准确性和检测效率高，具有较高通量，操作简便，可降低成本，通用性强。
A kit for detecting novel coronavirus orflab and S genes
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测新型冠状病毒orflab和S基因的试剂盒
本专利技术属于试剂盒检测
，具体涉及一种用于检测新型冠状病毒orf1ab和S基因的试剂盒。
技术介绍
冠状病毒属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。病毒基因组5′端具有甲基化的帽状结构，3′端具有poly(A)尾，基因组全长约27-32kb，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。冠状病毒仅感染脊椎动物，与人和动物的多种疾病有关，可引起人和动物呼吸道、消化道和神经系统疾病。迄今为止，共发现7种可感染人类的冠状病毒：HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、MERS-CoV和2019新型冠状病毒(2019-nCoV)。HCoV-229E和HCoV-NL63属于α属冠状病毒，HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-HKU1、MERS-CoV和2019新型冠状病毒(2019-nCoV)均属于β属冠状病毒，其中，HCoV-OC43和HCoV-HKU1属于A亚群，SARS-CoV属于B亚群，MERS-CoV属于C亚群。2019-nCoV是一种新型的冠状病毒，2019年12月31日武汉首次报道不明原因的病毒性肺炎，2020年1月7日病原体初步判定为新型冠状病毒，2020年1月13日NCBI公布其序列(Wuhanseafoodmarketpneumoniavirus，登录号MN908947)。同日，WHO将该病毒命名为2019新型冠状病毒(2019-nCoV)。截止到2019年3月6日累计报告新型冠状病毒感染的肺炎病例80718例，已治愈出院53853例，死亡3045例，新型冠状病毒给中国和全世界医疗卫生系统造成了严重危机，直接导致了巨大的生命财产损失。冠状病毒的实验室检测包括病毒核酸检测、抗原和抗体检测及作为病毒感染诊断“金标准”的病毒分离鉴定。其中，反转录－聚合酶链反应(ReverseTranscription-PolymeraseCha-inReaction,RT-PCR)因检测病毒核酸具有周期短、易标准化等优势而广泛应用于2019-nCoV肺炎的病原学诊断工作。冠状病毒结构比较复杂，用于基因检测的产品最好能覆盖2-3个相关的基因有利于后续的确诊工作，如世界卫生组织(WorldHealthOrganization，WHO)公布的MERS-CoV实验室诊断标准流程，就是以多靶标作为检测指标以增加PCR检测的准确性。本专利技术提供一种特异性、准确性和检测效率高，具有较高通量，操作简便，可降低成本，通用性强的用于检测新型冠状病毒orf1ab和S基因的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有用于检测新型冠状病毒的试剂盒的不足，提供一种用于检测新型冠状病毒orf1ab和S基因的试剂盒。本专利技术提供了如下的技术方案：一种用于检测新型冠状病毒orf1ab和S基因的试剂盒，包括RT-PCR反应液、RT-PCR反应酶系、阳性质控品和阴性质控品，所述RT-PCR反应液中含有PCR缓冲液、特异性的正、反向引物和异性荧光探针，序列信息如表1：表1优选的，所述阳性质控品由含有orf1ab和S基因目的序列的重组质粒组成，orf1ab基因目的序列为：TTGGAATTTGGTGCCACTTCTGCTGCTCTTCAACCTGAAGAAGAGCAAGAAGAAGATTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAACTGTTGGTCAACAAGACGGCAGTGAGGACAATCAGACAACTACTATTCAAACAATTGTTGAGGTTCAACCTCAATTAGAGATGGAACTTACACCAGTTGTS基因目的序列为：AGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGAC。优选的，所述PCR缓冲液由30-60mmol/LTris-HCl、3-8mmol/LMgCl2和150-350mmol/LKCl组成。优选的，所述RT-PCR反应酶系由逆转录酶、Taq酶和dNTPs组成，每份所述PCR反应酶系中逆转录酶的用量为1-3U，Taq酶的用量为2-5U，dNTPs为6-12mmol。优选的，所述S基因特异性荧光探针的5’标记有VIC荧光基团，3’标记有淬灭基团BHQ1，所述orf1a基因特异性荧光探针的5’标记有FAM荧光基团，3’标记有淬灭基团BHQ1。优选的，所述试剂盒中各特异性引物和探针的工作浓度如表2：表2优选的，所述阳性质控品为基因合成方式制备的含orf1ab和S基因目的全长的重组质粒DNA，且浓度为1ⅹ105copiesmL。进一步地，所述阴性质控品为生理盐水。基于上述结构，本专利技术还提供一种使用方法，包括以下步骤：S1.溶液制备：RT-PCR反应液(850μL/管)，RT-PCR反应酶系(150μL/管)，阳性质控品(200μL/管)，阴性质控品(1000μL/管)；S2.标准品的制备：紫外分光光度仪检测人工构建的重组质粒的浓度，并计算其质粒拷贝数，将质粒用DEPCH2O分别稀释至1.0×104copies/mL-1.0×102copies/mL即制得标准品；S3.试剂准备：取RT-PCR反应液17μL和RT-PCR反应酶系3μL充分混匀后备用；S4.加样：向三个PCR反应管中，分别加入5μL的阴性质控品、5μL阳性质控品和5μL标准品溶液，盖紧管盖，放入仪器的样品槽；S5.ABIPrism7500荧光定量PCR仪进行参数设定：打开Setup窗口，按对应顺序设置阴性质控品、阳性质控品和待测标本，并在Name栏中设置样品名称，选中所有设置样品孔，双击，选择AddDetector和Reporter为FAM、Quencher为none，再选择Reporter为HEX和Quencher为none，在PassiveReference中选择none，打开instrument窗口设置循环条件：50℃15分钟，95℃10分钟，95℃15秒，58℃45秒，45个循环，所有设置完成后保存文件，运行；S6.结果分析：反应结束后保存检测数据文件，在Results下打开Ampplot窗口，选择分析的目的样品所在位置，将Baseline数值改为start：3，stop：10，并打开manual设定Threshold：1.5±100000，双击Rn坐标上数值打开Graphsettings窗口，将PostRunSettings中Log改为Linear，OK后打开Analysispreferences窗口，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。本专利技术的有益效果是：(1)对2019-nCoV核酸扩增水平进行本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测新型冠状病毒orf1ab和S基因的试剂盒，其特征在于，包括RT-PCR反应液、RT-PCR反应酶系、阳性质控品和阴性质控品，所述RT-PCR反应液中含有PCR缓冲液、特异性的正、反向引物和异性荧光探针，序列信息如表1：/n表1/n
【技术特征摘要】
1.一种用于检测新型冠状病毒orf1ab和S基因的试剂盒，其特征在于，包括RT-PCR反应液、RT-PCR反应酶系、阳性质控品和阴性质控品，所述RT-PCR反应液中含有PCR缓冲液、特异性的正、反向引物和异性荧光探针，序列信息如表1：
表1
2.根据权利要求1所述的用于检测新型冠状病毒orf1ab和S基因的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品由含有orf1ab和S基因目的序列的重组质粒组成，
orf1ab基因目的序列为：
TTGGAATTTGGTGCCACTTCTGCTGCTCTTCAACCTGAAGAAGAGCAAGAAGAAGATTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAACTGTTGGTCAACAAGACGGCAGTGAGGACAATCAGACAACTACTATTCAAACAATTGTTGAGGTTCAACCTCAATTAGAGATGGAACTTACACCAGTTGT
S基因目的序列为：
AGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGAC。
3.根据权利要求2所述的用于检测新型冠状病毒orf1ab和S基因的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液由30-60mmol/LTris-HCl、3-8mmol/LMgCl2和150-350mmol/LKCl组成。
4.根据权利要求2所述的用于检测新型冠状病毒orf1ab和S基因的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应酶系由逆转录酶、Taq酶和dNTPs组成，每份所述PCR反应酶系中逆转录酶的用量为1-3U，Taq酶的用量为2-5U，dNTPs为6-12mmol。
5.根据权利要求2所述的用于检测新型冠状病毒orf1ab和S基因的试剂盒，其特征在于，所述S基因特异性荧光探针的5’标记有VIC荧光基团，3’标记有淬灭基团BHQ1，所述orf1a基因特异性荧光探针的5’标记有FAM荧光基团，3’标记有淬灭基团BHQ1。
6.根据权利要求2所述的一种用于检测新型冠状病毒orf1ab和S基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各特异性引物和探针的工作浓度如表2：
表2
【专利技术属性】
技术研发人员：周其伟，李望丰，孙国庆，方军，王刚，孙伟，
申请(专利权)人：江苏达伯药业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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