一种针对2019新型冠状病毒的核酸检测方法技术

本发明专利技术提供用于检测2019新型冠状病毒的检测方法及检测试剂盒，所述PCR引物是根据检测新型冠状病毒ORF1ab和Surface glycoprotein基因设计的两对引物。所述检测试剂盒包括Taq DNA聚合酶混合液、两对引物混合液，ddH

A novel coronavirus detection method for 2019 new viruses

【技术实现步骤摘要】
一种针对2019新型冠状病毒的核酸检测方法
本专利技术属于分子诊断
，具体涉及一种针对2019新型冠状病毒核酸检测试剂盒和检测方法。
技术介绍
冠状病毒是大型、带包膜的正链RNA病毒，属于巢病毒目冠状病毒科的正冠状病毒亚科，可分为4种属：α、β、δ、γ，可引起感冒以及中东呼吸综合征（MERS）和严重急性呼吸综合征（SARS）等较严重疾病。2019年12月以来新型冠状病毒COVID-19感染，属于β冠状病毒属，世界卫生组织（WHO）2月11日将这种致病病毒命名为COVID-19。人感染了冠状病毒后临床表现为发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。以支持治疗措施为主，针对并发症的预防或治疗，以及积极控制病人的其他慢性病。新型冠状病毒属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因组全长约29903个核苷酸，共包含10个基因。其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有明显区别，分别有70%和40%左右序列相似性。目前研究显示，新型冠状病毒与蝙蝠病毒TG13的全基因组序列一致性高达96%。S蛋白是病毒的主要蛋白之一，其编码基因用于病毒分型。N蛋白包裹病毒基因组，可作为诊断抗原。对冠状病毒S-蛋白和人ACE-2蛋白进行了结构对接研究，结果表明冠状病毒可能是通过S-蛋白与人ACE2互作的分子机制，来感染人的呼吸道上皮细胞。经过病毒序列比对分析，推测2019-nCoV自然宿主可能是蝙蝠。在从蝙蝠到人的传染过程中很可能存在未知的中间宿主媒介。聚合酶链式反应（PCR），特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。1.模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2.退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3.延伸：DNA模板-引物结合物在72℃，DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对原则，合成一条新的模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2-4分钟，1个半小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。琼脂糖凝胶电泳是指带电粒子或分子在电场中移动的现象称为电泳。核酸带负电，在琼脂糖凝胶电泳中从负极向正极移动，不同分子量的核酸带不同的电荷，在琼脂糖中移动的速度不同，从而分离不同长度的核酸片段。聚合酶链式反应（PCR）特异性高，采用两对特异性引物，高保真酶扩增两个目的基因片段，提高检测灵敏度及特异性，操作简便，检测周期短，可用作科学研究及临床诊断。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了用于检测2019新型冠状病毒核酸的试剂盒、检测方法，采取双特异性引物、采用高保真DNA聚合酶实现目的片段扩增。具有特异性强，灵敏度高的特点。采用PCR法进行扩增，简单高效，检测周期短。适用于任何实验室高校，以及各基层防控单位，医疗卫生单位等，具有重要现实意义。本专利技术第一方面提供一种用于检测2019新型冠状病毒核酸的引物，所述引物是根据国家公布的2019新型冠状病毒基因组的保守区ORF1ab和Surfaceglycoprotein基因序列，设计2对高效、特异性强的引物。2对引物在高保真DNA聚合酶及含有镁离子等成分的反应混合液中，通过普通PCR仪实现体外核酸的扩增。其特征在于ORF1ab基因特异性正向和反向引物ORF1ab-F，ORF1ab-R，Surfaceglycoprotein基因特异性正向和反向引物Surfaceglycoprotein-F，Surfaceglycoprotein-R。具体是：ORF1ab-F：5’-ACCTCATGGTCATGTTATGG-3’；ORF1ab-R：5’-GACATAGCGAGTGTATGCC-3’；Surfaceglycoprotein-F：5’-TTGGCAAAATTCAAGACTCACTTT-3’；Surfaceglycoprotein-R：5’-TGTGGTTCATAAAAATTCCTTTGTG-3’。ORF1ab基因的产物长度为322bp，Surfaceglycoprotein基因产物长度为547bp。由于条带短，反应时间可缩短至50分钟左右，不同的PCR仪器升温降温速率不同，但是总体上时间可以控制在50分钟左右。本专利技术第二方面提供了一种用于针对2019新型冠状病毒核酸的检测方法，包括以下步骤：(1)、以提取出来的cDNA作为标本，利用上述设计好的引物进行PCR扩增;(2)、对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，如果扩增出322bp则证明所述样品中含有ORF1ab基因，如果扩增出547bp大小条带则证明所述样品中含有Surfaceglycoprotein基因，如果都扩增出322bp、547bp大小条带证明所述样品中都有ORF1ab、Surfaceglycoprotein基因，证明存在2019新型冠状病毒。进一步地，所述步骤（1）中，PCR反应体系为：Taq酶反应混合液10μl（高保真Taq酶0.2U～5U，反应液PH值7.9～8.7，1.5mM～3mMMgCl2，5～15mMTris-HCl，40～50mMKCl，8～14mmoldNTPs），ORF1ab-F、ORF1ab-R、Surfaceglycoprotein-F、Surfaceglycoprotein-R共1μl，cDNA模板1μl，补加ddH2O至20μl。进一步地，所述步骤（1）中，PCR扩增的反应条件为：94℃3分钟；94℃10秒，58℃10秒，72℃10秒，36个循环；72℃2分钟。优选的，所述步骤（1）中，本专利技术优化反应时间仅为1小时，1小时就可以观察到检测结果。优选的，所述步骤（1）中，本专利技术提供2对高效、特异性强的引物，使检测结果更加严谨。优选的，所述步骤（1）中，本专利技术选择的TaqDNA聚合酶为高保真DNA聚合酶，以其无与伦比的扩增保真性（＞Taq酶的100倍）及其超低的错配率，提高反应速度、保真度和稳定性。本专利技术第三方面提供了一种用于检测2019新型冠状病毒核酸的试剂盒，包括本专利技术第一方面所述的两对特异性引物，还包括TaqDNA聚合酶反应混合液，阳性对照和阴性对照，ddH2O，DNAmarker。所述阳性对照为2019新型冠状病毒322bpOFR1ab和547bpSurfaceglycoprotein基因片段的DNA质粒，所述阴性对照为ddH2O。本专利技术的有益效果是：本专利技术所提供的PCR引物是针对2019新型冠状病毒基因组的保守区ORF1ab和Surfaceglycopro本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对2019新型冠状病毒核酸检测的特异性引物，其特征在于，所述引物根据检测2019新型冠状病毒ORF1ab和Surface glycoprotein特异性序列设计两对特异性引物，所述两对引物，分别为ORF1ab基因特异性正向和反向引物ORF1ab-F，ORF1ab-R，Surfaceglycoprotein基因特异性正向和反向引物Surface glycoprotein-F，Surfaceglycoprotein-R。/n

【技术特征摘要】
1.一种针对2019新型冠状病毒核酸检测的特异性引物，其特征在于，所述引物根据检测2019新型冠状病毒ORF1ab和Surfaceglycoprotein特异性序列设计两对特异性引物，所述两对引物，分别为ORF1ab基因特异性正向和反向引物ORF1ab-F，ORF1ab-R，Surfaceglycoprotein基因特异性正向和反向引物Surfaceglycoprotein-F，Surfaceglycoprotein-R。


2.具体是：ORF1ab-F：5’-ACCTCATGGTCATGTTATGG-3’；
ORF1ab-R：5’-GACATAGCGAGTGTATGCC-3’；
Surfaceglycoprotein-F：5’-TTGGCAAAATTCAAGACTCACTTT-3’；
Surfaceglycoprotein-R：5’-TGTGGTTCATAAAAATTCCTTTGTG-3’。


3.一种针对2019新型冠状病毒的核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、PCR扩增：以提取的cDNA为模板，利用权利要求1所述两对引物进行PCR扩增；
S2、扩增结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，如果扩增出322bp则证明所述样品中含有ORF1ab基因，如果扩增出547bp大小条带则证明所述样品中含有Surfaceglycoprotein基因，如果都扩增出322bp、547bp大小条带证明所述样品中都有ORF1ab、Surfaceg...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹秀山，尹瀛浩，单国峰，
申请(专利权)人：拜澳泰克沈阳生物医学集团有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21