降低引物二聚体形成且提高扩增效率的方法技术

本发明专利技术涉及在多重扩增反应中通过降低的引物二聚体形成来扩增至少三个靶核酸分子的方法。本发明专利技术的方法可有效抑制在与至少三个靶核酸分子有关的多重扩增反应中引物二聚体形成及非特异性扩增产物的生成。

Methods for Reducing Primer Dimer Formation and Increasing Amplification Efficiency

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】降低引物二聚体形成且提高扩增效率的方法【相关申请的交叉引用】本申请要求于2016年12月29日向韩国专利局提出的韩国专利申请第2016-0182955号的优先权，该韩国专利申请的全部内容在此引入本申请作为参考。
本专利技术涉及降低引物二聚体形成且提高扩增效率的方法。
技术介绍
核酸扩增作为在分子生物学上用于广泛的方法的必要的过程，被提出多种扩增方法。例如，在Miller，H.I.等(WO89/06700)中揭示了包括将启动子/引物序列与靶单链DNA(“ssDNA”)杂交后对上述序列的大量RNA复制进行转录的过程的核酸序列扩增方法。其他公知的核酸扩增方法包括基于转录的扩增系统(Kwoh，D.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86:1173(1989)；以及GingerasT.R.etal.，WO88/10315)。公知为聚合酶链式反应(以下，称为“PCR”)的最常用的核酸扩增方法包括双链DNA的变性、利用DNA模板的低聚核苷酸引物退火及基于DNA聚合酶的引物延伸的反复的循环过程(Mullis等，美国专利第4683195号、第4683202号及第4800159号；Saiki等，(1985)Science230，1350-1354)。基于PCR的技术不仅利用于靶DNA序列的扩增，而且还广泛利用于生物学及医学研究领域中的科学应用或方法，例如，逆转录酶PCR(RT-PCR)、差别显示PCR(DD-PCR)、基于PCR的公知或未知的基因的克隆、cDNA末端的快速扩增(RACE)、随机引物PCR(AP-PCR)、多重PCR、SNP基因组分型及基于PCR的基因组分析(McPhersonandMoller，2000)PCR.BIOSScientificPublishers，Springer-VerlagNewYorkBerlinHeidelberg，NY)。上述基于PCR的技术伴随着靶核酸分子的扩增，因此，仅要求准确且有效地扩增靶序列。为此，需要通过选择合适的序列及长度的引物并适当调节所使用的成分(例如，DNA聚合酶、dNTPs、Mg离子及缓冲液)的类型、含量及反应温度/时间来进行扩增反应。但是，在某些情况下，难以选择最佳的反应条件，而且在所选择的反应条件下也不能达到感到满意的扩增效率。为了更有效的扩增而开发了多种方法。另一方面，由于引物二聚体的形成而导致扩增效率的降低。关于此，在Lebedevatal中揭示了如下的方法，即，为了防止在初期反应中在低温条件下产生的引物的非特异性杂交，在引物的3’末端磷酸二酯键或第二个磷酸二酯键使用导入有4-氧代-1-戊基(OXP)磷酸三酯(PTE)基的引物来改善特异性及扩增效率(参照：Lebedevatal.，NucleicAcidsRes2008；36:e131)。引物通过与靶分子特异性杂交来开始进行扩增，因此对扩增反应的特异度及效率产生显著的影像。尤其，在使用多个引物的多重扩增反应中，更加强调引物的重要性。代表性地，为了最小化引物二聚体形成而使用变更与引物杂交的部位或调节引物的序列或长度的方法，但是适用于在多重扩增反应中所使用的引物设计中是有限的。因此，仍然需要有效抑制引物二聚体形成的新的方法，这种方法将会单独或通过与如上所述的公知的方法组合而以更经济且更简单的方式改善扩增效率。在本申请中，参照了多篇专利及引用文献并提供在括号内。这些专利及引用文献的揭示内容为了更详细地描述本专利技术及本专利技术所属的
而全部内容在此引入本申请作为参考。
技术实现思路
【技术问题】本专利技术人为了在多重扩增反应中，尤其在与至少三个靶核酸分子有关的多重扩增反应中可有效降低引物二聚体形成的方法而努力。其结果，本专利技术人发现，若在多重扩增反应中使用含有(多个)通用碱基核苷酸的(多个)引物，则抑制引物二聚体形成，从而可以提高扩增效率。因此，本专利技术的目的在于，提供通过降低的引物二聚体形成来扩增至少三个靶核酸分子的方法。本专利技术的再一目的在于，提供在与至少三个靶核酸分子有关的多重扩增反应中降低引物二聚体形成的方法。本专利技术的另一目的在于，提供用于在多重扩增反应中通过降低的引物二聚体形成来扩增至少三个靶核酸分子的试剂盒。本专利技术的还有一目的在于，提供包括为了使用通过降低的引物二聚体形成来扩增至少三个靶核酸分子的方法而使处理器设计引物对的指令的计算机可读存储介质。本专利技术的目的及优点通过结合所附的保护范围及附图和下述的说明而变得更加明确。【解决问题的手段】根据本专利技术的第一实施方式，本专利技术提供在多重扩增反应中通过降低的引物二聚体形成来扩增至少三个靶核酸分子的方法，包括：包括步骤(a)，制备分别包含正向引物及反向引物的至少三个引物对，上述每个引物对包含与对应的靶核酸分子有关的杂交核苷酸序列，上述至少一个引物对中的一个或两个引物为通用碱基引物(通用碱基引物)，上述通用碱基引物具有1～3个通用碱基核苷酸，上述通用碱基核苷酸中的一个或两个位于在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第六个核苷酸范围的核心区域，其余位于在通用碱基引物的5’-末端中的第四个核苷酸至在通用碱基引物的3’-末端中的第七个核苷酸的范围内，使用上述至少三个引物对的多重扩增反应通过降低的引物二聚体形成来生成靶核酸分子的扩增产物，上述通用碱基核苷酸在通用碱基引物具有非连续性；步骤(b)，使用上述至少三个引物对进行包括引物退火、引物延伸及变性的至少两次循环的多重扩增反应，上述多重扩增反应通过降低的引物二聚体形成来生成靶核酸分子的扩增产物。本专利技术人为了在多重扩增反应中，尤其在与至少三个靶核酸分子有关的多重扩增反应中可有效降低引物二聚体形成的方法而努力。其结果，本专利技术人发现，若在多重扩增反应中使用含有(多个)通用碱基核苷酸的(多个)引物，则抑制引物二聚体形成，从而可以提高扩增效率。在以往的核酸扩增反应中，可通过引物之间的杂交来偶然生成如引物二聚体的非特异性副产物。本专利技术涉及抑制非特异性副产物中的引物二聚体。本文中所使用的术语“引物二聚体(primerdimer)”是指两个引物通过相互杂交(inter-hybridization)或者单引物通过自杂交(intra-hybridization；self-hybridization)来形成的杂交物(hybrid)。尤其，引物二聚体包含通过与相同或不同的靶核酸分子杂交的引物对来形成的杂交物。并且，本文中所使用的引物二聚体不仅包含两个引物的杂交物自身，而且还包含组成杂交物的一个或两个引物链延伸的延伸产物。可根据引物二聚体的每个引物链延伸与否来将引物二聚体分类为三种：(i)不可延伸的引物二聚体；(ii)一条链可延伸的引物二聚体；以及(iii)两条链可延伸的引物二聚体(参照图2)。本文中所使用的不可延伸的引物二聚体是指杂交后两个引物链不被核酸聚合酶延伸的引物二聚体(参照图2的上部列)。本文中所使用的一条链可延伸的引物二聚体是指杂交后两个引物链中的一个被核酸聚合酶延伸的引物二聚体(参照图2的中间列)。两条链可延伸的引物二聚体是指杂交后两个引物链被核酸聚合酶延伸的引物二聚体(参照图2的下部列)。根据本专利技术人所进行的实验，不可延伸的引物二聚体或一条链可延伸的引物二聚体的形成对靶核酸分子的扩增产生的影本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.在多重扩增反应中通过降低的引物二聚体形成来扩增至少三个靶核酸分子的方法，其包括：步骤(a)，制备分别包含正向引物及反向引物的至少三个引物对，上述每个引物对包含与对应的靶核酸分子有关的杂交核苷酸序列，上述至少一个引物对中的一个或两个引物为通用碱基引物，上述通用碱基引物具有1～3个通用碱基核苷酸，上述通用碱基核苷酸中的一个或两个位于在通用碱基引物的3’‑末端中的第三个核苷酸至第六个核苷酸范围的核心区域，其余位于在通用碱基引物的5’‑末端中的第四个核苷酸至在通用碱基引物的3’‑末端中的第七个核苷酸的范围内，使用上述至少三个引物对的多重扩增反应通过降低的引物二聚体形成来生成靶核酸分子的扩增产物，上述通用碱基核苷酸在通用碱基引物具有非连续性；步骤(b)，使用上述至少三个引物对进行包括引物退火、引物延伸及变性的至少两次循环的多重扩增反应，上述多重扩增反应通过降低的引物二聚体形成来生成靶核酸分子的扩增产物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.29 KR 10-2016-01829551.在多重扩增反应中通过降低的引物二聚体形成来扩增至少三个靶核酸分子的方法，其包括：步骤(a)，制备分别包含正向引物及反向引物的至少三个引物对，上述每个引物对包含与对应的靶核酸分子有关的杂交核苷酸序列，上述至少一个引物对中的一个或两个引物为通用碱基引物，上述通用碱基引物具有1～3个通用碱基核苷酸，上述通用碱基核苷酸中的一个或两个位于在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第六个核苷酸范围的核心区域，其余位于在通用碱基引物的5’-末端中的第四个核苷酸至在通用碱基引物的3’-末端中的第七个核苷酸的范围内，使用上述至少三个引物对的多重扩增反应通过降低的引物二聚体形成来生成靶核酸分子的扩增产物，上述通用碱基核苷酸在通用碱基引物具有非连续性；步骤(b)，使用上述至少三个引物对进行包括引物退火、引物延伸及变性的至少两次循环的多重扩增反应，上述多重扩增反应通过降低的引物二聚体形成来生成靶核酸分子的扩增产物。2.权利要求1的方法，其中所述核心区域为在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第五个核苷酸的范围，其余位于在通用碱基引物的5’-末端中的第四个核苷酸至在通用碱基引物的3’-末端中的第六个核苷酸的范围的区域内。3.权利要求1的方法，其中所述至少一个引物对中的两个引物为通用碱基引物。4.权利要求1的方法，其中每个引物对中的一个或两个引物为通用碱基引物。5.权利要求1的方法，其中所使用的引物的总数中的50％为通用碱基引物。6.权利要求1的方法，其中所述通用碱基引物中的至少一个不包含多义碱基。7.权利要求1的方法，其中至少五个引物对使用于至少五个靶核酸分子的扩增。8.权利要求1的方法，其中在上述多重扩增反应中，在50℃以上的温度下进行引物退火。9.权利要求1的方法，其中相比于使用包含与上述靶核酸序列互补的自然产生核苷酸(A、C、G或T(U))的引物来代替上述至少一个通用碱基引物时，在多重扩增反应中通过降低的引物二聚体形成来扩增至少三个靶核酸分子的方法产生至少高3％的靶扩增效率。10.权利要求1的方法，其中在不存在靶核酸分子的条件下从使用包含通用碱基引物的引物对的反应获得的Ct值相比于在不存在靶核酸分子的条件下从使用由以往的引物组成的引物对的反应获得的Ct值增加1以上。11.权利要求1的方法，其中为了检测上述靶核酸分子的存在而在存在至少三个额外的探针的条件下进行上述多重扩增反应，每个上述至少三个探针包含与需要扩增的靶核酸分子有关的杂交核苷酸序列且位于正向引物及反向引物之间。12.权利要求11的方法，其中所述至少三个探针不具有通用碱基核苷酸。13.权利要求1的方法，其中所述通用碱基核苷酸选自：脱氧肌苷、肌苷、7-脱氮-2’-脱氧肌苷、2-氮杂-2’-脱氧肌苷、2’-OMe肌苷、2’-F肌苷、脱氧3-硝基吡咯、3-硝基吡咯、2’-OMe3-硝基吡咯、2’-F3-硝基吡咯、1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯、脱氧5-硝基吡咯、5-硝基吲哚、2’-OMe5-硝基吲哚、2’-F5-硝基吲哚、脱氧4-硝基苯并咪唑、4-硝基苯并咪唑、脱氧4-氨基苯并咪唑、4-氨基苯并咪唑、脱氧水粉蕈素、2’-F水粉蕈素、2’-F4-硝基苯并咪唑、PNA-5-introindole、PNA-水粉蕈素、PNA-肌苷、PNA-4-硝基苯并咪唑、PNA-3-硝基吡咯、吗啉基-5-硝基吲哚、吗啉基-水粉蕈素、吗啉基-肌苷、吗啉基-4-硝基苯并咪唑、吗啉基-3-硝基吡咯、氨基磷酸酯-5-硝基吲哚、氨基磷酸酯-水粉蕈素、氨基磷酸酯-肌苷、氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑、氨基磷酸酯-3-硝基吡咯、2’-O-甲氧基乙基肌苷、2’-O-甲氧基乙基水粉蕈素、2’-O-甲氧基乙基5-硝基吲哚、2’-O-甲氧基乙基4-硝基苯并咪唑、2’-O-甲氧基乙基3-硝基吡咯及它们的组合。14.权利要求13的方法，其中所述通用碱基核苷酸包含脱氧肌苷、肌苷或它们的组合。15.在与至少三个靶核酸分子有关的多重扩增反应中降低引物二聚体形成的方法，其包括：步骤(a)，确定需要扩增的至少三个靶核酸分子；步骤(b)，确定分别包含正向引物及反向引物的至少三个引物对的核苷酸序列，上述每个引物包含与对应的靶核酸分子有关的杂交核苷酸序列；步骤(c)，利用通用碱基核苷酸从上述至少三个引物对中的至少一个引物对中取代一个或两个引物中的1～3个核苷酸来制备通用碱基引物，利用上述通用碱基核苷酸所进行的取代抑制引物二聚体形成，上述通用碱基引物具有1～3个通用碱基核苷酸，上述通用碱基核苷酸中的一个或两个位于在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第六个核苷酸范围的核心区域，其余位于在通用碱基引物的5’-末端中的第四个核苷酸至在通用碱基引物的3’-末端中的第七个核苷酸的范围的区域，上述通用碱基核苷酸在通用碱基引物具有非连续性；步骤(d)，利用上述至少三个引物对进行包括引物退火、引物延伸及变性的至少两次循环的多重扩增反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：李荣祚，金大荣，
申请(专利权)人：SEEGENE株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国,KR