使用纳米孔表征分析物的方法和系统技术方案

使用纳米孔表征分析物的方法。一个方面的特征在于使用纳米孔表征双链多核苷酸，例如不使用连接所述双链多核苷酸的模板和互补序列的发夹的方法。另一方面的特征在于使用标签修饰的纳米孔表征分析物的方法，其具有增加的灵敏度和/或更高的通量。还提供了可以用于所述方法中的组合物和系统，其包括例如用于附接于双链多核苷酸的衔接子和标签修饰的纳米孔。

Methods and systems for characterizing analytes using nanoporous materials

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用纳米孔表征分析物的方法和系统
本文所提供的涉及使用纳米孔表征分析物的方法。还提供了可以用于所述方法中的组合物和系统，包括例如用于附接于分析物，如双链多核苷酸的衔接子，和标签修饰的纳米孔。在一些实施方案中，本文提供了使用跨膜孔为一种或多种靶多核苷酸测序的方法。
技术介绍
当前在广泛的应用范围内需要快速且便宜的多核苷酸(例如，DNA或RNA)测序和鉴定技术。跨膜孔(例如，纳米孔)已用于鉴定小分子或折叠的蛋白质并用于监测单分子水平的化学或酶促反应。跨膜孔(例如，纳米孔)作为聚合物和各种小分子的直接、电生物传感器具有巨大的潜力。具体来说，最近正在关注纳米孔作为潜在的DNA测序技术和生物标志物识别。可以在跨纳米孔施加的电位差下测量通过纳米孔的离子流。分析物与纳米孔的相互作用可以引起离子流的特征变化，并且对所产生的信号的测量可以用于表征分析物。例如，测得的信号可以是电流的，并且可以例如用于确定多核苷酸的序列。可以使多核苷酸链易位通过该孔，并且可以从测得的信号得到核苷酸的同一性，如序列。此类测序方法公开于例如WO0142782、WO2016034591、WO2013041878、WO2014064443和WO2013153359中。已经开发了用于为双链多核苷酸测序的方法，例如涉及通过发夹连接的模板和互补链的易位。链测序通常涉及使用多核苷酸结合蛋白(如解旋酶)来控制多核苷酸通过纳米孔的运动。此类方法公开于例如WO2013057495中。纳米孔的尺寸可以使其仅允许单链多核苷酸易位。双链多核苷酸可以通过在易位通过纳米孔之前将链分离以提供单链多核苷酸来确定。多核苷酸结合蛋白如解旋酶可用于同时分离双链多核苷酸并控制所得单链易位通过纳米孔的速率。双链多核苷酸的两条链可以通过桥接部分如发夹环连接，并且制备此类构建体的方法描述于例如WO2013057495中。这确保在正向(模板)链易位之后反向(互补)链易位。以这种方式测量两条链是有利的，因为来自两条相连互补链的信息可以组合并用于提供比仅测量模板链可以获得的置信度更高的观察结果。然而，此类发夹连接的多核苷酸的制备会增加样品制备时间并导致有价值的分析物的损失。此外，发夹连接的模板和互补多核苷酸链易位通过纳米孔可以引起纳米孔的另一(反)侧上的链的再杂交。这可以改变易位速率，从而降低测序精确度。此外，由于模板链和互补链的电流-时间数据的差异，使用两种算法进行计算，这使得计算更加复杂和密集。因此，需要改进的表征分析物(例如双链多核苷酸)的方法，其具有提高的精确度和更高的效率/通量。
技术实现思路
本公开总体上涉及使用纳米孔表征分析物的方法和可用于本文所述方法中的组合物，例如衔接子和纳米孔。本公开内容部分基于意外发现，双链多核苷酸的两条链均可以依次易位通过纳米孔以提供序列信息，而不需要通过桥接部分(如发夹环)共价连接两条链。例如，在一些实施方案中，可以向双链多核苷酸的每个末端提供具有双链体茎的衔接子，所述衔接子茎包含与缀合至纳米孔的孔标签互补的捕获序列，其中捕获序列仅在该链解链时显露。因此，当双链多核苷酸的第一链穿过标签修饰的纳米孔时，它拉开衔接子的双链体茎以暴露双链多核苷酸的第二链上的捕获序列，然后被纳米孔的孔标签捕获。此类方法不但使第二链保持靠近纳米孔，而且缩短了读取第一链和第二链之间的时间延迟，从而提高了测序方法的总体精确度和效率。还发现在纳米孔处捕获随后易位通过纳米孔的多种分析物可以增强表征分析物的灵敏度和/或通量。本专利技术人还发现，当使用多核苷酸结合蛋白分离双链多核苷酸的两条链，同时控制其中一条链通过跨膜孔的运动时，第二链可以留在孔附近并且在第一链易位通过孔之后，第二链可以被孔捕获，并且多核苷酸结合蛋白可以用于控制第二链通过孔的运动。因此，本专利技术的一个方面提供了为靶多核苷酸测序的方法，其包括：(a)使跨膜孔接触：(i)包含靶多核苷酸和与靶多核苷酸互补的多核苷酸的双链多核苷酸，其中靶多核苷酸和与靶多核苷酸互补的多核苷酸各自包含单链前导序列；和(ii)能够分离双链多核苷酸的链并控制多核苷酸通过跨膜孔的运动的多核苷酸结合蛋白；(b)检测对应于通过所述孔的离子流的信号，以检测易位通过所述孔的多核苷酸；(c)鉴定对应于所述靶多核苷酸的易位的信号和对应于与所述靶多核苷酸互补的多核苷酸的单独易位的连续信号；(d)分析(c)中鉴定的所述信号，从而为所述靶多核苷酸测序。在这方面，双链条形码序列可以附接于靶双链多核苷酸的一端或两端，前导序列可以包含在衔接子中，衔接子可以包含双链区和至少一个单链区，所述衔接子可以包含双链条形码序列，所述衔接子可以包含膜系链或孔系链，附接于靶双链多核苷酸的两个末端的前导序列可以不同，所述双链多核苷酸可以在其每个末端具有不同衔接子和/或多核苷酸结合蛋白，如解旋酶或聚合酶，可以与前导序列结合。当多核苷酸结合蛋白与前导序列结合时，多核苷酸结合蛋白的活性可以停滞，直到多核苷酸与跨膜孔接触。当双链条形码序列附接于靶双链多核苷酸的一端或两端时，可以将唯一的条形码序列附接于样品中的每个双链多核苷酸。在这方面，双链多核苷酸可以附接于微粒和/或可以修饰孔以增强多核苷酸的捕获。例如，吸引或结合多核苷酸或衔接子的一个或多个分子可以与孔连接。此类分子可选自，例如，PNA标签、PEG接头、短寡核苷酸、带正电荷的氨基酸和适体。在这方面，跨膜孔可以是，例如，蛋白质孔，如源自或基于Msp、α-溶血素(α-HL)、胞溶素、CsgG、ClyA、Sp1或FraC的孔，或固态孔和/或膜可以是两亲性层或固态层。该方法优于为双链多核苷酸测序的已知方法，其中两条链使用桥接部分如发夹环连接。该方法也优于仅测量模板多核苷酸链的已知方法。具体而言，本专利技术的方法结合了仅模板链的方法和发夹环方法的优点，而没有所提到的发夹环方法的缺点。例如，WO2013/014451中公开的方法使用多个衔接子，并且样品中仅一些双链多核苷酸将在一端添加Y衔接子，在另一端添加包含桥接部分的衔接子，丢弃样品中的其他多核苷酸。本专利技术的方法可以使用可以添加到双链多核苷酸的两端的单个前导序列或衔接子来进行。当使用此类单个前导序列/衔接子的系统时，需要丢弃较少的样品(如果有的话)。在该方法中，双链靶多核苷酸的任一端均可被孔捕获。与WO2013/014451中公开的方法相比，这提高了灵敏度，其中只有不包含桥接部分的双链多核苷酸的末端可被孔捕获。本专利技术还提供了衔接子群体，其包含双链条形码序列、单链前导序列和能够分离双链多核苷酸的链并控制多核苷酸通过跨膜孔的运动的多核苷酸结合蛋白，其中所述群体中的每个衔接子中的条形码序列是唯一的。本文提供的另一方面涉及表征多核苷酸的方法。多核苷酸可包含DNA或RNA。所述方法包括：(i)在溶液中组合：(a)包含具有模板链和互补链的双链多核苷酸的构建体，其中所述模板链和所述互补链不共价连接，与(b)纳米孔，其中与所述构建体的一部分结合的一个或多个标签与所述纳米孔缀合，其中所述构建体和所述纳米孔在所述构建体与所述纳米孔结合的条件下组合；(ii)提供条件以便容许所述构建体的模板链进入所述纳米孔，以便容许所述模板链的分离和所述模板链的至少一部分易位通过所述纳米孔；(iii)测量指示所述模板链易位通过所述纳米孔的性质的变化；并且本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表征多核苷酸的方法，所述方法包括：(i)在溶液中组合：a)包含具有模板链和互补链的双链多核苷酸的构建体，其中所述模板链和所述互补链不共价连接，与b)纳米孔，其中与所述构建体的一部分结合的一个或多个标签与所述纳米孔缀合，其中所述构建体和所述纳米孔在所述构建体与所述纳米孔结合的条件下组合；(ii)提供条件以便容许所述构建体的模板链进入所述纳米孔，以便容许所述模板链的分离和所述模板链的至少一部分易位通过所述纳米孔；(iii)测量指示所述模板链易位通过所述纳米孔的性质的变化；并且(iv)基于在所述模板链易位通过所述纳米孔时所测量的性质变化来表征所述多核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.01 GB 1620450.5;2017.03.14 US 62/471,3381.一种表征多核苷酸的方法，所述方法包括：(i)在溶液中组合：a)包含具有模板链和互补链的双链多核苷酸的构建体，其中所述模板链和所述互补链不共价连接，与b)纳米孔，其中与所述构建体的一部分结合的一个或多个标签与所述纳米孔缀合，其中所述构建体和所述纳米孔在所述构建体与所述纳米孔结合的条件下组合；(ii)提供条件以便容许所述构建体的模板链进入所述纳米孔，以便容许所述模板链的分离和所述模板链的至少一部分易位通过所述纳米孔；(iii)测量指示所述模板链易位通过所述纳米孔的性质的变化；并且(iv)基于在所述模板链易位通过所述纳米孔时所测量的性质变化来表征所述多核苷酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液是离子的并且所测量的性质是通过所述纳米孔的离子电流。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中衔接子附接于所述双链多核苷酸的两个末端中的一个或两个上，每个衔接子包含双链体茎和从所述双链体茎延伸的第一单链，其中一个衔接子的第一单链与所述模板链邻接且另一个衔接子的第一单链与所述互补链邻接。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一个或多个标签与所述纳米孔的外缘缀合。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述条件是所述纳米孔上的电位差。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纳米孔置于膜内。7.根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其中与所述衔接子的一部分结合的一个或多个标签与所述纳米孔缀合。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述一个或多个标签与所述纳米孔的外缘缀合。9.根据权利要求3至8中任一项所述的方法，其中步骤ii)包括：在所述膜上施加电位差，以便容许与所述构建体的所述模板链邻接的所述第一单链进入所述纳米孔，将所述纳米孔上的电位差保持足够时间段，以便容许所述模板链分离和所述模板链的至少一部分易位通过所述纳米孔。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤iii)包括测量当所述模板链易位通过所述纳米孔时通过所述纳米孔的离子电流的变化。11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤iv)包括基于在所述模板链易位通过所述纳米孔时所测量的通过所述纳米孔的离子电流的变化来表征所述多核苷酸。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中多核苷酸解链酶存在于所述溶液中所述纳米孔的顺式-开口侧。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中一种或多种多核苷酸解链酶与所述多核苷酸预先结合。14.根据权利要求3至13中任一项所述的方法，其中多核苷酸解链酶与两个衔接子中的一个或每一个预先结合。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述纳米孔的内腔中提供多核苷酸解链酶。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纳米孔还起到使所述多核苷酸解链的作用。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纳米孔是马达蛋白质纳米孔，任选其为phi29。18.根据权利要求3至17中任一项所述的方法，其中对于每个衔接子，多核苷酸解链酶与从所述双链体茎延伸的第一单链结合。19.根据权利要求18所述的方法，其中通过其相应结合的多核苷酸解链酶促进所述模板链的解链。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与所述构建体的一部分结合的所述一个或多个标签中的至少一个是与所述构建体部分具有序列互补性的核酸。21.根据权利要求3至20中任一项所述的方法，其中与所述构建体的一部分结合的所述一个或多个标签中的至少一个是与所述衔接子的部分具有序列互补性的核酸。22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述核酸不带电荷。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述核酸是PNA或吗啉基。24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含RNA和/或DNA。25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸的解链使所述互补链的一部分露出以与标签杂交。26.根据权利要求9至25中任一项所述的方法，其中与所述寡核苷酸具有互补性的所述衔接子的部分位于与所述第一单链邻接的链上的双链体茎内，并且其中将所述电位差保持足够时间段以容许所述多核苷酸解链到使得其第一单链与所述互补链邻接的所述衔接子的部分可用于与标签杂交的程度。27.根据权利要求25或26所述的方法，其还包括保持所述条件足够时间段以在所述模板链易位通过所述纳米孔之后容许所述互补链进入所述纳米孔并且使所述纳米孔易位。28.根据权利要求26所述的方法，其还包括保持所述电位差足够时间段，以在所述模板链易位通过所述纳米孔之后容许与所述互补链邻接的所述第一单链进入所述纳米孔并且容许所述互补链易位通过所述纳米孔。29.根据权利要求28所述的方法，其还包括测量指示所述互补链易位通过纳米孔的性质的变化。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述性质是当所述互补链易位通过所述纳米孔时通过所述纳米孔的离子电流。31.根据权利要求29或30所述的方法，其还包括进一步基于所测量的指示所述互补链易位通过所述纳米孔的性质的变化来表征所述多核苷酸。32.根据权利要求31所述的方法，其中获得指示所测量的指示所述互补链和所述模板链均易位通过所述纳米孔的性质的数据并用于表征所述多核苷酸。33.根据权利要求32所述的方法，其中将所述模板链数据与所述互补链数据进行比较或组合以表征所述多核苷酸。34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纳米孔包含第一标签和第二标签，并且所述第一标签和所述第二标签分别与所述衔接子的所述第一单链邻接所述模板链的一部分和与所述衔接子的所述第一单链邻接所述互补链的一部分结合。35.根据权利要求3至34中任一项所述的方法，其中每个衔接子包含从所述双链体茎延伸的第二单链，其中所述一个衔接子的所述第二单链与所述互补链邻接和/或所述另一个衔接子的所述第二单链与所述模板链邻接。36.根据权利要求35所述的方法，其中与所述衔接子的一部分结合的一个或多个标签中的至少一个是与所述衔接子在所述第二单链内的一部分具有序列互补性的寡核苷酸。37.根据权利要求36所述的方法，其中与所述衔接子的一部分结合的一个或多个标签中的两个或更多个是与所述衔接子在所述第二单链内的一部分具有序列互补性的寡核苷酸。38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其还包括基于当所述模板链易位通过所述孔时所述测量性质的变化的测量来确定所述模板链的序列，基于当所述互补链易位通过所述孔时所述测量性质的变化的测量来确定所述互补链的序列，比较所述模板链的序列与所述互补链的序列以确定所述多核苷酸的序列。39.一种用于表征多核苷酸的系统，所述系统包括：(i)包含具有模板链和互补链的多核苷酸的构建体，和(ii)置于膜中的纳米孔，所述纳米孔包括与至少一种核酸缀合的外缘，所述核酸与所述衔接子的一部分具有序列互补性。40....

【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯·克拉克，詹姆斯·怀特，理查德·马斯喀特，杰西卡·玛丽·梅·克诺特，拉米兹·伊克巴尔·纳撒尼，安德鲁·约翰·赫伦，马克·约翰·布鲁斯，拉科马·尼尚萨·贾亚辛格，多梅尼科·卡普罗蒂，戴维·杰克逊·斯托达特，瑞贝卡·维多利亚·鲍恩，克里斯多夫·詹姆斯·莱特，保罗·理查德·穆迪，
申请(专利权)人：牛津纳米孔技术公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB